鸡传染性支气管炎病毒HH06株单克隆抗体制备及抗原捕捉ELISA方法建立

发布时间：2017-06-30 06:23

  本文关键词：鸡传染性支气管炎病毒HH06株单克隆抗体制备及抗原捕捉ELISA方法建立，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：鸡传染性支气管炎(Avian infectious bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病,给养禽业造成巨大的经济损失。IBV血清型的复杂与多样性加大了IBV的诊断难度,因此快速和高效的诊断方法对制定针对性的综合防治方案有着深远的意义。本实验以IBV HH06株为免疫原,免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠,经细胞融合、间接ELISA筛选和有限稀释法克隆,最终得到3株能够稳定分泌抗IBV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,将它们命名为A8、B11和H5,然后利用腹水制备法大量制备单克隆抗体。单克隆抗体细胞上清和腹水抗体效价分别是1:128-1:1 024和1:8 192-1:65 356,腹水抗体效价明显高于细胞上清。Western blot结果显示所有单克隆抗体均与IBV全病毒和S1蛋白发生特异性反应,IFA鉴定表明单抗可检测到感染鸡胚肾细胞(chicken embro kidney,CEK)中的HH06株IBV。Ig亚类鉴定A8、B11和H5均属于Ig M,其杂交瘤细胞染色体计数平均数量在86-101条,病毒中和试验显示单抗A8、B11和H5抗IBV HH06中和效价分别为1:4.45、1:4.86和1:3.06,特异性试验证明3株单抗仅与IBV发生特异性反应,不与禽传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)、传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、禽白血病(avian leukosis virus,ALV)和新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)产生交叉反应,以上结果表明本实验所制备的单抗可以用作IBV检测方法的物质材料。抗原捕捉ELISA是一种快速高效的抗原检测手段,兔抗IBV全病毒多抗为捕捉抗体,单克隆抗体B11作为检测抗体,通过对各个条件进行优化,得到最佳反应条件为:兔抗IBV多抗稀释倍数为1:4 000,鼠抗IBV单抗B11检测浓度为5μg/m L,待检样品孵育时间90 min,酶标二抗稀释倍数为1:5 000。该方法板间、板内重复性变异系数均小于10%,最低检出量为0.007 mg/m L,与阴性尿囊液及其他参考鸡病病原无交叉反应。利用建立的AC-ELISA对M41株人工感染IBV雏鸡不同时间肾脏、肺脏和气管组织的多份样本进行检测,结果表明肾脏含毒量高且持续时间长,且检测敏感性最高,肺脏和气管次之,因此,该临床检测所选用的靶器官为肾脏,并将0.158(OD490 nm)作为阴阳性判定标准,因不同毒株侵染的组织器官具有一定的特异性,同时以肺脏和气管作为辅助检测的器官。综上表明,建立的抗原捕捉ELISA方法具有较好的特异性和敏感性,可用于IBV的快速检测。
【关键词】：IBV 单克隆抗体 抗原捕捉ELISA 检测
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 摘要8-9
• 英文摘要9-11
• 1 前言11-21
• 1.1 IBV病原学11-14
• 1.1.1 IBV基因组结构11-12
• 1.1.2 IBV结构蛋白12-14
• 1.2 IB流行病学14
• 1.3 IB致病机理14-15
• 1.4 IB临床症状和病理变化15-16
• 1.5 IB诊断技术16-19
• 1.5.1 血清学诊断方法16
• 1.5.2 病毒分离16-17
• 1.5.3 电镜鉴定17
• 1.5.4 免疫组织化学17-18
• 1.5.5 分子生物学诊断18-19
• 1.5.6 鉴别诊断19
• 1.6 IBV单克隆抗体研究进展19
• 1.7 研究目的和意义19-21
• 2 材料与方法21-33
• 2.1 实验材料21-24
• 2.1.1 病毒株和质粒21
• 2.1.2 动物及细胞21
• 2.1.3 酶和主要试剂21-22
• 2.1.4 主要试剂配制22-23
• 2.1.5 仪器设备23-24
• 2.2 实验方法24-33
• 2.2.1 IBV单克隆抗体的制备24-27
• 2.2.2 单克隆抗体生物学特征鉴定27-29
• 2.2.3 抗原捕捉ELISA方法建立与应用29-32
• 2.2.4 数据统计32-33
• 3 结果33-52
• 3.1 IBV单克隆抗体的制备33-34
• 3.1.1 免疫抗原的制备33
• 3.1.2 ELISA筛选方法的建立33-34
• 3.1.3 杂交瘤细胞的筛选34
• 3.1.4 腹水制备34
• 3.2 单克隆抗体生物学特征鉴定34-42
• 3.2.1 单克隆抗体浓度与效价测定34-35
• 3.2.2 单克隆抗体Western blot鉴定35-37
• 3.2.3 单克隆抗体IFA检测37-39
• 3.2.4 杂交瘤细胞分泌单克隆抗体稳定性试验39
• 3.2.5 杂交瘤细胞染色体计数39-40
• 3.2.6 单克隆抗体Ig亚类鉴定40-41
• 3.2.7 单克隆抗体中和活性鉴定41-42
• 3.2.8 单克隆抗体特异性分析42
• 3.3 IBV抗原捕捉ELISA（AC-ELISA）方法建立与应用42-52
• 3.3.1 抗原捕捉ELISA优化42-48
• 3.3.2 抗原捕捉ELISA方法特异性试验48
• 3.3.3 抗原捕捉ELISA方法灵敏性试验48-49
• 3.3.4 抗原捕捉ELISA方法重复性试验49-50
• 3.3.5 M41株IBV人工感染样本的检测50-52
• 4 讨论52-55
• 4.1 抗原的制备52
• 4.2 单克隆抗体的制备52-53
• 4.3 单克隆抗体生物学特性鉴定53-54
• 4.4 AC-ELISA检测方法建立54-55
• 5 结论55-56
• 致谢56-57
• 参考文献57-65
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文65

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本文编号：500923