应用LCM技术结合冰冻切片捕获奶牛生精细胞及RNA的提取

发布时间：2017-07-06 05:12

  本文关键词：应用LCM技术结合冰冻切片捕获奶牛生精细胞及RNA的提取

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【摘要】：精原细胞经过减数分裂后生成圆形精子细胞,再经变态发育,最终成为成熟精子,在变态发育过程中,染色质高度固缩,转录活性逐渐降低,并伴随细胞质的大量丢失,导致精子细胞内RNA含量极少。目前,精子内种类繁多的RNA成分虽已被检测证实,但精子是否存在转录活性仍存在较大争议,因此,研究精子变态前后转录表达趋势具有重要意义。本实验室前期对模式动物小鼠精子发育过程的转录表达进行了研究,通过高通量测序发现在圆形、长形精子细胞和成熟精子间存在大量差异表达基因,且通过荧光定量PCR验证了结果的可靠性。对于荷斯坦牛精子发育过程中的转录表达是否和啮齿动物有相同的变化趋势,其与体细胞的差异性仍需进行深入研究。本实验采集了荷斯坦牛睾丸及附睾组织,在前期小鼠实验基础上,通过延长组织块平衡和切片染色时间及加大激光能量及频率等条件优化,建立了合适的荷斯坦牛睾丸组织冰冻切片制作、染色及激光显微切割捕获体系。通过优化后的体系共捕获了90 576个圆形精子细胞、122 651个长形精子细胞及67 818个精原干细胞样品(每样品各三个生物学重复),并通过精子浮游法获得107个附睾尾精子,为后续研究提供了可靠的实验材料。由于精子难以裂解、RNA含量低,且制备难度大,本研究比较了两种试剂盒及Trizol法三种RNA制备方法的制备效果,发现RNeasy Kit的RNA制备效率高且效果稳定(单个精子RNA含量为0.023~0.025 pg),可以用于后续高通量测序RNA样品的制备。并采用PicoPureTMRNA Isolation Kit进行了圆形、长形精子细胞及精原干细胞的RNA制备。在进行精子RNA制备时,采用的体细胞裂解液进行了白细胞、上皮细胞等体细胞的去除,并利用白细胞和上皮细胞的特异表达基因CD45和CDH1及持家基因GAPDH(跨内含子设计引物)进行反转录聚合酶链式反应(Reverse transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测体细胞及基因组污染,以确保后续高通量测序的RNA样品质量。另外,本研究通过大量细胞样本,测算了单个生精细胞RNA含量,单因子方差分析结果显示,圆形精子细胞、长形精子细胞、附睾尾精子及精原干细胞RNA含量有显著差异,不但二倍体细胞(精原干细胞)和生殖细胞间存在显著差异(P0.05),随着精子细胞的变态发育,其RNA含量逐渐减少,精子细胞圆形和长形精子细胞中RNA含量分别为附睾尾精子的752和413倍。采用Smart-seq2方法对各级生精细胞cDNA进行微量扩增,并检测其cDNA量及完整性,各样品cDNA含量均高于20 ug,且在1~2 kb间均有目的产物,完整性较好,符合建库要求。本研究根据牛睾丸组织特点建立了的冰冻切片方法和细胞取样技术体系,并获得了大量圆形、长形精子细胞和精原干细胞样品;同时得到了高效的精子RNA制备方法,并获得了变态期间的单细胞RNA含量及变化趋势;另外通过微量cDNA扩增获得了足够量且完整的cDNA,为精子RNA高通量测序奠定了基础,同时也为精子发生与变形机理研究提供了重要参考。
【关键词】：生精细胞 冰冻切片 激光显微切割 附睾尾精子 RNA
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第一章 文献综述11-18
• 1.1 精子变形期间转录本存在巨大差异12
• 1.2 活力不同精子间转录本差异较大12-13
• 1.3 获能前后精子转录本发生了较大差异13-14
• 1.4 精子冷冻前后转录本产生较大差异14
• 1.5 冰冻切片技术14-15
• 1.6 激光显微切割技术15-16
• 1.7 转录组测序技术16-17
• 1.8 展望17
• 1.9 本研究的目的、意义与研究内容17-18
• 第二章 试验材料与方法18-30
• 2.1 试验材料18-20
• 2.1.1 试验动物18
• 2.1.2 主要仪器设备与试剂耗材18-19
• 2.1.2.1 主要试验仪器设备及厂商18
• 2.1.2.2 主要试剂及购买公司18-19
• 2.1.2.3 试验耗材19
• 2.1.3 主要试验试剂的配制19-20
• 2.2 技术路线20-21
• 2.3 试验方法21-30
• 2.3.1 样品的采集21-23
• 2.3.1.1 睾丸及附睾的采集21
• 2.3.1.2 附睾尾精子的采集及活力检测21-22
• 2.3.1.3 圆形、长形精子细胞及精原干细胞的获取22-23
• 2.3.2 总RNA制备23-25
• 2.3.2.1 精子总RNA制备23-25
• 2.3.2.2 圆形、长形精子细胞及精原干细胞RNA提25
• 2.3.2.3 睾丸组织RNA提取25
• 2.3.3 总RNA质量评估25-28
• 2.3.3.1 总RNA浓度、OD值得测定25
• 2.3.3.2 总RNA基因组、体细胞去除效果检测25-28
• 2.3.4 统计分析28
• 2.3.5 cDNA扩增及质量检测28-30
• 2.3.5.1 反转录28
• 2.3.5.2 PCR预扩增28-29
• 2.3.5.3 cDNA质量检测29-30
• 第三章 试验结果与分析30-43
• 3.1 样品的采集30-33
• 3.1.1 附睾尾精子采集及活力检测30
• 3.1.2 圆形、长形精子细胞及精原干细胞的获取30-33
• 3.2 RNA质量检测33-37
• 3.2.1 三种方法提取的精子RNA质量检测33-34
• 3.2.1.1 精子RNA浓度及OD值检测33
• 3.2.1.2 凝胶电泳检测33-34
• 3.2.2 各样品总RNA制备效果检测34-37
• 3.2.2.1 各样品总RNA浓度及OD值检测34
• 3.2.2.2 单个生精细胞RNA含量34-35
• 3.2.2.3 总RNA凝胶电泳检测结果35
• 3.2.2.4 基因组DNA去除效果检测35-36
• 3.2.2.5 体细胞去除效果检测36-37
• 3.3 生精细胞的RNA含量37
• 3.4 CDNA扩增质量检测37-43
• 3.4.1 cDNA浓度检测37-38
• 3.4.2 cDNA完整性检测38-43
• 第四章 讨论与结论43-47
• 4.1 讨论43-46
• 4.1.1 关于冰冻切片制作43-44
• 4.1.2 关于切片染色44
• 4.1.3 关于激光显微切割技术44
• 4.1.4 关于精子RNA提取方法44-45
• 4.1.5 关于生精细胞总RNA凝胶电泳检测45
• 4.1.6 关于基因组和体细胞污染检测45
• 4.1.7 关于生精细胞RNA含量分析45-46
• 4.1.8 关于cDNA扩增46
• 4.2 全文结论46-47
• 参考文献47-53
• 致谢53-54
• 作者简历54

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