气肿疽梭菌Dot-ELISA方法的建立及初步应用

发布时间：2017-07-06 05:13

  本文关键词：气肿疽梭菌Dot-ELISA方法的建立及初步应用

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【摘要】：气肿疽梭菌(Closridium chauvoei.)是一种产芽孢的梭状杆菌,产生的芽孢可长期存活在土壤中,经消化道或粘膜侵入机体,引起恶性水肿和气性坏疽等症状,具有传染性,可以感染人。针对该病的诊断尚无标准的血清学检测技术。因此,本研究旨在以制备的标准阳性血清为抗体建立一种快速、简便而且灵敏的血清学诊断方法,为日后气肿疽诊断制剂的研制奠定理论与实践基础。本试验成功的纯化了由气肿疽梭菌标准株C54-1的提取的有效抗原,以特异性最强的纯化抗原免疫豚鼠,经四次免疫后获得的血清以1 000倍稀释后,用ELISA检测其ODl150nm值达1.6以上,并经Dot-ELISA方法重复性试验研究表明,该血清特异性和稳定性优良,可作为气肿疽梭菌双抗体夹心Dot-ELISA方法的一抗用于检测。筛选最适反应条件是Dot-ELISA验的重点。通过反复优化,确定抗体最佳稀释度为1：1024；可检测到最低菌体抗原量为3.125μ g,最低分泌抗原量为1.89 μg；最适酶标二抗浓度为1：4 000。采用双抗体夹心Dot-ELISA方法、AGID法和PCR法同时检测30只致病豚鼠肝脏和脾脏碾磨液,结果Dot-ELISA方法与PCR法阳性符合率为93.3%,阳性检出率是AGID法的2.5倍,表明该方法灵敏度很高。用试验建立的双抗体夹心Dot-ELISA检测实验室已确诊病料,30份阳性样本中检出26份阳性结果,远远高于AGID法的检出率,证明该方法准确性较高。本试验是国内首次应用标准株气肿疽梭菌纯化抗原免疫SPF豚鼠制备的标准血清为一抗包被载体膜,建立了快速检测气肿疽病原体毒素的双抗体夹心Dot-0ELISA诊断方法,该方法较ELISA法有更高的特异性和敏感性,可以检测到微量气肿疽梭菌毒素,且抗体用量少、易于保存、不需要特殊仪器、操作方便快捷,有望生产为试剂盒应用于临床实践对气肿疽的快速检测。
【关键词】：气肿疽梭菌 标淮阳性血清 Dot-ELISA 菌体抗原 分泌抗原
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-10
• 前言10-16
• 1 病原体简介10-11
• 1.1 菌体特征10
• 1.2 培养特征10-11
• 1.3 毒素特征11
• 2 流行病学及临床症状特征11-12
• 3 实验室诊断方法12-13
• 3.1 传统的诊断方法12
• 3.2 血清学诊断方法12-13
• 3.3 分子生物学诊断13
• 4 气肿疽的危害13-14
• 5 防治措施14
• 6 Dot-ELISA简介14-15
• 7 本试验研究的目的及意义15-16
• 材料与方法16-28
• 1 材料16-21
• 1.1 制备抗原用试剂16
• 1.2 SDS-PAGE和Western blotting16-19
• 1.3 Dot-ELISA用材料19
• 1.4 间接ELISA用材料19-20
• 1.5 PCR和AGID20
• 1.6 试验动物20
• 1.7 试验仪器20-21
• 2 方法21-28
• 2.1 肝片肉汤培养基21
• 2.2 血液琼脂培养基21-22
• 2.3 气肿疽梭菌培养22
• 2.4 生长曲线的测定22
• 2.5 抗原的初步提取22
• 2.6 气肿疽梭菌抗原的纯化22
• 2.7 纯化抗原反应原性分析22-23
• 2.8 豚鼠的免疫程序23
• 2.9 动物模型的建立及被检抗原的提取23
• 2.10 双抗体夹心Dot-ELISA方法的建立23-24
• 2.11 最佳工作条件的筛选24-26
• 2.12 特异性试验26
• 2.13 重复性试验26
• 2.14 敏感性实验26
• 2.15 比较试验26-27
• 2.16 快诊膜对已知病牛样本的检测27
• 2.17 快速诊断膜的保存期试验27-28
• 结果28-43
• 1 气肿疽梭菌培养结果28-29
• 2 生长曲线的测定29
• 3 初提抗原的制备及被检抗原含量测定29
• 4 气肿疽梭菌纯化抗原的洗脱曲线29-30
• 5 纯化抗原SDS-PAGE分析30-31
• 6 纯化抗原Western blot分析31-32
• 7 气肿疽梭菌标准血清制备结果32-33
• 7.1 豚鼠免疫程序32
• 7.2 间接ELISA方法条件的优化32-33
• 8 Dot-ELISA的判定标准33-34
• 9 Dot-ELISA程序的优化34-38
• 9.1 血清最适稀释倍数的确定34
• 9.2 被检抗原最适浓度的确定34-35
• 9.3 酶标二抗最适稀释倍数的确定35-36
• 9.4 最适封闭液及封闭时间的确定36
• 9.5 底物最适显色温度及时间的确定36
• 9.6 最适包被液的确定36-37
• 9.7 最适样品稀释液的确定37
• 9.8 洗涤液及洗涤次数的确定37
• 9.9 最适反应温度的确定37
• 9.10 最适反应时间的确定37
• 9.11 快诊膜的选择37-38
• 10 特异性试验38-40
• 10.1 交叉反应试验38-39
• 10.2 阻断试验39-40
• 11 重复性试验40
• 12 敏感性试验40-41
• 13 比较试验41
• 14 快诊膜对已知病牛样本的检测41-42
• 15 诊断膜的保存期试验42-43
• 讨论43-45
• 结论45-46
• 参考文献46-50
• 致谢50-51
• 作者简介51

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本文编号：524856