用于口蹄疫疫苗生产的BHK悬浮细胞培养工艺的开发

发布时间：2017-07-06 22:01

  本文关键词：用于口蹄疫疫苗生产的BHK悬浮细胞培养工艺的开发

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【摘要】：作为传染性最强的家畜传染病之一,口蹄疫一旦爆发将给畜牧业乃至国民经济造成巨大经济损失甚至影响国际贸易。接种安全、经济、有效的疫苗是预防口蹄疫至关重要的环节。传统的转瓶生产工艺往往存在操作复杂、生产规模放大困难、疫苗产率较低等问题。此外,血清的添加也将导致疫苗成本的上升、生产过程中安全隐患的增加及疫苗质量难以控制等困境。因此,开发适于BHK细胞悬浮培养的无血清培养基,驯化获得适于无血清悬浮培养的BHK细胞,并建立基于BHK细胞无血清悬浮培养的病毒生产工艺势在必行。首先,利用DOE实验设计方法中的Mixture design和Response surface design实验法,成功开发了一种适于BHK细胞悬浮生长的无血清培养基,能支持细胞生长的最大活细胞密度达到(8.66±0.07)×106 cells/ml,平均比生长速率为(0.85±0.04)d-1。其次,利用优化后的无血清培养基进行BHK贴壁细胞的悬浮适应,并考察驯化成功的BHK悬浮细胞的形态、生长代谢规律及产毒能力。结果发现,利用无血清培养基PM仅需15天即可驯化获得悬浮生长的BHK细胞。驯化成功的BHK悬浮细胞连续传代时平均比生长速率高达0.90 d-1,且批培养中获得的最大活细胞密度较低血清商业培养基提高了24.79%,稳定期延长了48 h。最后,初步探索了初始接种密度和离心换液接毒对病毒在细胞中扩增的影响。通过采用实验确定的最优初始接种密度0.5×106 cells/ml和离心换液接毒,无血清培养基PM和低血清商业培养基中病毒的TCID50均在接毒后16 h达到最大,分别为7.01gTCIDso/0.1 ml和7.121gTCIDso/0.1 ml。由此可见,两种培养基在用于病毒扩增时具有相类似的水平,初步证实了无血清培养基PM可用于口蹄疫病毒的生产。通过本文的工作,开发了适用于BHK悬浮细胞生产口蹄疫疫苗的无血清培养基,驯化获得了可无血清悬浮培养的BHK细胞,初步探索了建立基于BHK悬浮细胞的无血清全悬浮口蹄疫疫苗生产工艺的可行性,为工业规模批量生产口蹄疫疫苗提供了借鉴和数据支持。
【关键词】：BHK细胞 口蹄疫病毒 无血清培养基 无血清悬浮培养
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S859.797
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 缩略词对照表10-11
• 第1章 文献综述11-22
• 1.1 动物细胞培养技术概况11-12
• 1.1.1 动物细胞培养技术的发展与历史11-12
• 1.1.2 动物细胞培养技术在疫苗生产中的应用12
• 1.2 口蹄疫病毒和口蹄疫疫苗12-16
• 1.2.1 口蹄疫12-13
• 1.2.2 口蹄疫病毒13-15
• 1.2.3 口蹄疫疫苗15-16
• 1.3 基于动物细胞悬浮培养技术生产口蹄疫疫苗16-21
• 1.3.1 口蹄疫疫苗生产现状16-17
• 1.3.2 BHK细胞17
• 1.3.3 BHK细胞无血清培养基17-19
• 1.3.4 口蹄疫疫苗生产工艺控制19
• 1.3.5 接毒过程控制的意义和应用19-21
• 1.4 本文研究的目的意义与主要研究内容21-22
• 第2章 材料和方法22-27
• 2.1 实验材料22-24
• 2.1.1 细胞株和口蹄疫病毒株22
• 2.1.2 培养基22-23
• 2.1.3 实验仪器和材料23-24
• 2.2 实验方法24-25
• 2.2.1 贴壁细胞培养24
• 2.2.2 悬浮细胞培养24
• 2.2.3 病毒感染24-25
• 2.3 分析方法25
• 2.3.1 细胞计数25
• 2.3.2 病毒滴度TCID_(50)的检测25
• 2.3.3 细胞代谢的检测25
• 2.4 数据计算25-27
• 2.4.1 细胞活力25
• 2.4.2 细胞比生长速率25-26
• 2.4.3 IVCC26
• 2.4.4 代谢速率26-27
• 第3章 适用于BHK细胞悬浮生长的基础培养基筛选及优化27-42
• 3.1 引言27
• 3.2 实验方案27-31
• 3.3 结果与讨论31-40
• 3.3.1 几种常见商业培养基中BHK细胞驯化生长31-33
• 3.3.2 混料实验中BHK细胞生长33-34
• 3.3.3 初筛培养基用于细胞的驯化和细胞状态的评价34-36
• 3.3.4 植物蛋白肽的组成对BHK细胞生长的影响36-38
• 3.3.5 四种关键组分的浓度对BHK细胞生长的影响38-40
• 3.4 本章小结40-42
• 第4章 BHK细胞悬浮培养的可行性研究和相关评价42-52
• 4.1 引言42
• 4.2 实验方案42-43
• 4.3 结果与讨论43-50
• 4.3.1 BHK细胞的无血清驯化43-44
• 4.3.2 驯化后BHK细胞的生长及代谢情况44-48
• 4.3.3 3L生物反应器无血清批培养BHK细胞48-49
• 4.3.4 细胞产毒能力的考察49-50
• 4.4 本章小结50-52
• 第5章 基于BHK细胞无血清悬浮培养生产口蹄疫疫苗的过程优化52-59
• 5.1 引言52
• 5.2 实验方案52-53
• 5.3 结果与讨论53-58
• 5.3.1 初始接种密度对口蹄疫病毒增殖和接毒后细胞裂解情况的影响53-54
• 5.3.2 换液对口蹄疫病毒增殖和接毒后细胞裂解情况的影响54-57
• 5.3.3 优化后接毒工艺的验证57-58
• 5.4 本章小结58-59
• 第6章 全文总结及展望59-62
• 6.1 全文总结59-60
• 6.2 展望60-62
• 参考文献62-67
• 致谢67-68
• 所发表论文68-69
• 卷内备考表69

【参考文献】

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本文编号：527902