ABCG2基因对奶牛乳腺上皮细胞转运黄曲霉毒素M1的影响

发布时间：2017-07-08 12:00

  本文关键词：ABCG2基因对奶牛乳腺上皮细胞转运黄曲霉毒素M1的影响

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【摘要】：黄曲霉毒素(AF)被划定为I类致癌物,黄曲霉毒素B1(AFB1)是一种主要的黄曲霉毒素,其污染物大大降低了食物的安全水平,对人类的健康有重大的威胁。黄曲霉毒素M1(AFM1)是AFB1的二次毒性代谢产物,奶牛摄入被AFB1污染的饲料,15min后可在血液中检测到AFM1,8h后可在奶中检测到AFM1。部分AFM1会随乳汁、尿液排出,一部分则留在动物的可食用的组织和器官如血、肾、肝等。AFM1在乳汁中最为常见,这使得牛奶及其奶制品成为易受AFM1污染的食品。因此深入研究奶牛血乳屏障对AFM1摄取的机理,将有助于有效地减少奶牛乳腺上皮细胞对血液循环中AFM1的摄取,从而保证我国牛奶以及奶制品的质量安全。为了研究奶牛血乳屏障对AFM1的摄取方式以及转运AFM1的分子机理,本实验采用中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞进行原代培养,细胞以1×106个/mL的密度接种在Transwell小室的聚碳酸酯膜上,在体外构建了奶牛血乳屏障模型。在体外构建的奶牛血乳屏障是由单一的乳腺上皮细胞增殖而来。激光扫描共聚焦结果显示,乳腺上皮细胞之间形成了较好的紧密连接,而且乳腺上皮细胞仍具有合成酪蛋白的功能。所以在体外构建的奶牛血乳屏障模型可以成为体外研究药物在血乳屏障中转运机理的模型。为了研究奶牛乳腺上皮细胞对AFM1的摄取方式,通过采用荧光定量PCR检测了在培养体系中添加AFM1对体外构建的奶牛血乳屏障中ABCG2、ABCC5、ABCC1、ABCB1、ABCC3、5-HT、SLC22A5和SLC22A4基因mRNA表达量的影响,结果显示在血乳屏障中ABCG2和ABCB1表达量较高,有可能参与AFM1在血乳屏障中的转运。同时,我们也采用Western blotting方法检测了在培养体系中添加AFM1对ABCG2和ABCB1蛋白表达量的影响,结果显示与不添加AFM1培养的奶牛乳腺上皮细胞相比,ABCG2和ABCB1蛋白表达量显著提高(P0.01),这种结果更大程度上表明ABCG2和ABCB1转运蛋白参与AFM1转运的可能性。为了进一步研究ABCG2对AFM1转运作用的影响,试验构建重组质粒pGCMV-ABCG2-IRES-EGFP对细胞进行瞬时转染,从而进行ABCG2基因的过表达试验研究;同时应用RNA干扰的方法用ABCG2 si RNA对细胞进行瞬时转染,从而进行ABCG2基因的抑制试验研究。再通过采用荧光定量PCR和Western blotting检测在培养体系中添加AFM1对体外构建的奶牛血乳屏障中转运蛋白ABCG2 mRNA和蛋白表达量的影响,同时采用液相色谱法对收集的细胞和Transwell上室的培养液中AFM1的含量进行检测。荧光定量PCR和Western blotting结果显示:ABCG2基因的过表达和抑制对ABCG2 mRNA和蛋白表达量均有极显著性影响(P0.01),而对β-酪蛋白的表达均无显著性影响(P0.05)。AFM1液相色谱结果显示:ABCG2基因过表达上调细胞以及上室培养液中AFM1的含量(P0.01),ABCG2基因抑制下调细胞以及上室培养液中AFM1的含量(P0.01)。综上所述,ABCG2基因参与了AFM1转运的过程,但未参与奶牛乳腺上皮细胞泌乳和细胞增殖的调节。对于ABCG2基因参与AFM1转运机理还需进行深入的研究。
【关键词】：奶牛 血乳屏障 AFM1 转运蛋白 ABCG2基因
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
【目录】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 前言12-18
• 1.1 黄曲霉毒素的研究进展12-14
• 1.1.1 黄曲霉毒素研究的背景12
• 1.1.2 AFM1及其毒性的研究12-13
• 1.1.3 AFM1稳定性的研究13-14
• 1.1.4 牛奶及其他奶制品中AFM1的规范要求14
• 1.2 血乳屏障的研究进展14-16
• 1.2.1 上皮细胞紧密连接蛋白的研究14
• 1.2.2 乳房炎对血乳屏障影响的研究14-15
• 1.2.3 血乳屏障模型的体外构建研究进展15-16
• 1.3 药物转运蛋白的研究概况16-17
• 1.4 研究的目的与意义17-18
• 2 材料与方法18-29
• 2.1 主要的实验材料、仪器与试剂18
• 2.1.1 实验材料18
• 2.1.2 实验仪器18
• 2.1.3 实验试剂18
• 2.2 实验方法18-29
• 2.2.1 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养18-19
• 2.2.2 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定19
• 2.2.3 筛选奶牛乳腺上皮细胞体外培养的最佳接种密度19-22
• 2.2.4 体外血乳屏障模型的构建22
• 2.2.5 AFM1对乳腺上皮细胞外源性化合物转运蛋白的影响22-25
• 2.2.6 ABCG2基因过表达对奶牛乳腺上皮细胞的影响25-27
• 2.2.7 ABCG2基因抑制对奶牛乳腺上皮细胞的影响27-28
• 2.2.8 数据处理与统计分析28-29
• 3 结果与分析29-50
• 3.1 奶牛乳腺上皮细胞的体外培养与鉴定29-32
• 3.1.1 奶牛乳腺上皮细胞的纯化与鉴定29
• 3.1.2 奶牛乳腺上皮细胞角蛋白18的鉴定29-30
• 3.1.3 奶牛乳腺上皮细胞最佳接种密度的筛选30-31
• 3.1.4 奶牛乳腺上皮细胞生长曲线的测定31-32
• 3.2 奶牛血乳屏障体外的构建与鉴定32-33
• 3.2.1 倒置显微镜下观察奶牛乳腺上皮细胞32
• 3.2.2 扫描电镜下观察奶牛乳腺上皮细胞32-33
• 3.2.3 免疫荧光染色检测紧密连接蛋白ZO-133
• 3.3 AFM1对奶牛乳腺上皮细胞中转运蛋白表达的影响33-37
• 3.3.1 AFM1的剂量关系33-34
• 3.3.2 AFM1的时间关系34
• 3.3.3 AFM1对ABCB1和ABCG2蛋白表达水平的影响34-35
• 3.3.4 AFM1对β-酪蛋白的蛋白表达水平的影响35-36
• 3.3.5 AFM1对奶牛乳腺上皮细胞细胞增殖的影响36-37
• 3.4 ABCG2基因过表达的实验结果37-43
• 3.4.1 去内毒素质粒的双酶切法验证37-38
• 3.4.2 最佳转染时间的筛选38
• 3.4.3 ABCG2基因过表达转染效率的检测38-39
• 3.4.4 ABCG2基因过表达对奶牛乳腺上皮细胞转运AFM1的影响39-42
• 3.4.5 ABCG2基因过表达对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响42
• 3.4.6 ABCG2基因过表达对奶牛乳腺上皮细胞增殖作用的影响42-43
• 3.5 ABCG2基因抑制的实验结果43-50
• 3.5.1 ABCG2 siRNA最佳干扰片段和最佳干扰时间43-44
• 3.5.2 干扰效率的检测44-45
• 3.5.3 ABCG2基因抑制对奶牛乳腺上皮细胞转运AFM1的影响45-48
• 3.5.4 ABCG2基因抑制对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响48
• 3.5.5 ABCG2基因抑制对奶牛乳腺上皮细胞增殖作用的影响48-50
• 4 讨论50-53
• 4.1 奶牛血乳屏障的建立与鉴定50-51
• 4.2 AFM1对奶牛乳腺上皮细胞中转运蛋白的影响51
• 4.3 ABCG2基因过表达与抑制对AFM1在奶牛乳腺上皮细胞中转运的影响51-53
• 5 结论53-54
• 致谢54-55
• 参考文献55-64
• 附录64-65
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文65

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本文编号：534410