布鲁菌OMP16对RAW264.7细胞凋亡与免疫活性的影响及其免疫原性研究

发布时间：2017-07-27 13:31

  本文关键词：布鲁菌OMP16对RAW264.7细胞凋亡与免疫活性的影响及其免疫原性研究

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【摘要】：布鲁菌(Brucella)可侵染动物和人,引起重要的人兽共患病布鲁菌病(Brucellosis)。布鲁菌病属于二类传染病,是世界五大人兽共患病——狂犬病、炭疽、布鲁菌病、结核和猪流行性乙型脑炎之一。疫苗免疫是布鲁菌病综合防控的重要措施之一,而现有疫苗存在各方面的缺陷,不宜普遍使用。因此对新型疫苗的研发是布鲁菌研究的主要目标之一。目前已知的布鲁菌外膜蛋白(outer membrane proteins,OMPs)有7种,研究表明布鲁菌OMP16和OMP19也是重要的保护性抗原。本研究制备布鲁菌OMP16,优化其表达与纯化的条件;在RAW264.7细胞培养液中添加布鲁菌OMP16,通过检测细胞凋亡标志因子Caspase-3、内质网应激主要因子GRP78和CHOP及免疫因子IL-1β、IL-6、TNF-α的变化情况,探讨布鲁菌OMP16对RAW264.7细胞凋亡与免疫活性的影响;同时用布鲁菌OMP16免疫Balb/c小鼠,检测血清抗体水平,并进行小鼠感染试验,观察试验动物的临床表现、脾脏变化,检测免疫因子,研究布鲁菌OMP16的免疫原性。试验结果如下:1.原核表达并通过NTA树脂亲和层析柱纯化布鲁菌OMP16,SDS-PAGE检测目的蛋白的浓度。分别在22℃、26℃、30℃温度条件下诱导7 h、8 h、9 h、10 h表达蛋白,用不同浓度咪唑20 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、250 mmol/L、500 mmol/L纯化蛋白。确定的最佳条件:22℃诱导8 h,100 mmol/L与250 mmol/L咪唑洗脱2次。2.布鲁菌OMP16在不同浓度及时间下刺激RAW264.7细胞,采用MTT法及Hoechst染色法筛选出OMP16的最佳作用浓度及时间:10μg/mL,36 h。设置OMP16刺激RAW264.7细胞组及对照组,用免疫荧光法及Western blot检测到细胞凋亡的主要标志因子Caspase-3的表达量显著升高(P0.001),实时定量PCR及Western blot检测到内质网应激主要因子GRP78与CHOP的表达显著升高,流式细胞术检测到布鲁菌OMP16刺激RAW264.7细胞发生了显著凋亡,结果表明OMP16能够促进细胞凋亡且内质网应激参与了OMP16促进RAW264.7细胞凋亡的调节。同时通过实时定量PCR检测到免疫因子IL-1β、IL-6、TNF-α均表达上调,证明布鲁菌OMP16能够激发RAW264.7细胞的免疫活性。3.OMP16免疫组小鼠ELISA检测血清抗体效价平均达到1∶106,进行感染试验,感染第3天感染组小鼠开始表现精神沉郁、体重显著下降、进食量减少、怕冷发抖、围成一团,对照组、免疫感染组小鼠均不表现上述症状;实时定量PCR检测小鼠第7天脾脏中免疫因子IL-1β、IL-6、TNF-α,与ELISA检测血清免疫因子显示感染组小鼠免疫因子的分泌显著上升,免疫感染组与对照组的基本一致;结果表明布鲁菌OMP16具有良好的免疫原性,并且对布鲁菌感染具有一定的免疫保护作用。
【关键词】：布鲁菌OMP16 免疫原性 RAW264.7细胞 内质网应激 免疫因子 小鼠
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要5-7
• abstract7-11
• 文献综述11-22
• 第一章 布鲁菌致病机制及防控研究进展11-22
• 1.1 布鲁菌感染机制11-13
• 1.2 布鲁菌致病因子13-17
• 1.2.1 脂多糖13-14
• 1.2.2 外膜蛋白14-17
• 1.2.3 Ⅳ型分泌系统17
• 1.3 内质网应激与布鲁菌感染17-19
• 1.3.1 内质网应激介导的细胞凋亡18
• 1.3.2 内质网应激与布鲁菌感染18-19
• 1.4 布鲁菌病防控19-20
• 1.5 本研究目的意义及内容20-22
• 试验研究22-51
• 第二章 布鲁菌OMP16原核表达及纯化22-29
• 2.1 材料22-23
• 2.1.1 载体和感受态细菌22
• 2.1.2 主要试剂22
• 2.1.3 实验仪器22-23
• 2.2 方法23-25
• 2.2.1 pET-32a-OMP16原核表达载体鉴定23-24
• 2.2.2 布鲁菌OMP16的表达纯化及鉴定24-25
• 2.3 结果25-27
• 2.3.1 pET-32a-OMP16原核表达载体鉴定25-26
• 2.3.2 布鲁菌OMP16纯化及鉴定26-27
• 2.4 讨论27-28
• 2.5 小结28-29
• 第三章 布鲁菌OMP16对RAW264.7 细胞凋亡与免疫活性影响29-43
• 3.1 材料29-30
• 3.1.1 细胞株29
• 3.1.2 主要试剂29-30
• 3.1.3 实验仪器30
• 3.2 方法30-35
• 3.2.1 OMP16作用于RAW264.7 细胞的最佳浓度及时间30-31
• 3.2.2 OMP16诱导RAW264.7 细胞凋亡的检测31-33
• 3.2.3 OMP16诱导RAW264.7 细胞内质网应激主要因子检测33-34
• 3.2.4 OMP16刺激RAW264.7 细胞相关免疫因子检测34-35
• 3.3 结果35-41
• 3.3.1 OMP16最佳作用浓度及时间筛选35-37
• 3.3.2 RAW264.7 细胞凋亡检测37-39
• 3.3.4 RAW264.7 细胞内质网应激主要因子检测结果39-40
• 3.3.3 RAW264.7 细胞免疫因子检测结果40-41
• 3.4 讨论41-42
• 3.5 小结42-43
• 第四章 布鲁菌OMP16免疫原性研究43-51
• 4.1 材料43
• 4.1.1 实验动物及菌株43
• 4.1.2 主要试剂43
• 4.1.3 实验仪器43
• 4.2 方法43-45
• 4.2.1 小鼠免疫试验44
• 4.2.2 小鼠感染试验44-45
• 4.3 结果45-49
• 4.3.1 免疫小鼠血清抗体效价检测45
• 4.3.2 感染试验45-49
• 4.4 讨论49-50
• 4.5 小结50-51
• 结论51-52
• 参考文献52-59
• 致谢59-60
• 作者简介60

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本文编号：581688