IBV双抗体夹心ELISA检测方法的建立及免疫胶体金试纸条的研制

发布时间：2017-07-27 14:21

  本文关键词：IBV双抗体夹心ELISA检测方法的建立及免疫胶体金试纸条的研制

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【摘要】：本试验用辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)对单克隆抗体11C10进行标记,将单克隆抗体2D6包被于酶标板上,建立了用抗体2D6和11C10夹心检测鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus, IBV)的酶联免疫吸附检测方法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA),并对建立的ELISA方法中各步反应的条件进行了优化。通过验证结果显示,建立的双抗体夹心ELISA检测方法检测鸡传染性支气管炎病毒时检测结果呈阳性而在检测其他鸡的传染病病毒时结果呈阴性;将鸡传染性支气管炎病毒尿囊液稀释160倍后,建立的双抗体夹心ELISA检测方法仍能够检测得到。运用双抗体夹心的原理,制备了粒径为25nm的胶体金溶液,用胶体金溶液标记纯化过的单克隆抗体11C10后将其吸附于玻璃纤维膜上作为金标垫;将单克隆抗体2D6和羊抗鼠二抗印迹于层析膜上做检测线和质控线：将金标垫、层析膜和吸水纸等按顺序组装研制了检测鸡传染性支气管炎病毒的胶体金免疫层析快速检测试纸条。并对试纸条制备过程中金标抗体稀释液、金标抗体稀释度、包被抗体稀释度和羊抗鼠二抗稀释度等条件进行了优化,初步研制出能够快速检测鸡传染性支气管炎病毒的试纸条,试纸条能够检测稀释80倍后的病毒尿囊液且检测其他病毒结果呈阴性。用研制的试纸条和双抗体夹心ELISA方法同时检测55份疑似感染IB的鸡口咽拭子样品,结果表明,鸡传染性支气管炎病毒免疫胶体金诊断试纸条检测结果与双抗体夹心ELISA检测结果符合率较高达到92.73%,具有操作方便并且现场结果显示快速的优点,在IBV的临床快速检测方面具有重要意义。
【关键词】：鸡传染性支气管炎 ELISA 胶体金
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 摘要7-8
• 前言8-17
• 1 传染性支气管炎概述8-13
• 1.1 病原学8-9
• 1.2 IBV基因组结构特征9
• 1.3 IBV的结构蛋白及生物学功能9-11
• 1.4 IB的临床症状分型及其剖检变化11-12
• 1.5 IB的诊断12-13
• 2 免疫胶体金技术13-17
• 2.1 胶体金概述13-14
• 2.2 免疫胶体金概述14
• 2.3 免疫胶体金检测技术14-17
• 第一章 IBV双抗体夹心ELISA检测方法的建立17-26
• 1 材料与方法17-20
• 1.1 材料、仪器及主要试剂17-18
• 1.2 试验方法18-20
• 2 结果与分析20-24
• 2.1 IBV抗原的制备20-21
• 2.2 抗体的纯化21
• 2.3 双抗体夹心ELISA最佳操作条件的优化21-22
• 2.4 临界值的确定22-23
• 2.5 ELISA重复性、敏感性、特异性的确定23-24
• 3 讨论24-25
• 3.1 样本的影响24
• 3.2 材料、试剂的影响24
• 3.3 加样24
• 3.4 洗板24-25
• 3.5 温育25
• 3.6 显色与结果判定25
• 4 小结25-26
• 第二章 IBV胶体金免疫检测试纸条的研制26-39
• 1 材料与方法26-32
• 1.1 材料与试剂26
• 1.2 试验方法26-32
• 2 试验结果32-36
• 2.1 胶体金的制备32
• 2.2 胶体金标记抗体32-33
• 2.3 金标垫的制备33
• 2.4 硝酸纤维膜上单抗和二抗包被浓度的优化33-34
• 2.5 胶体金免疫层析试纸条性能评价34-36
• 2.6 胶体金试纸条与双抗体夹心ELISA检测方法检测临床样品的比较36
• 3 讨论36-38
• 3.1 胶体金的制备36-37
• 3.2 抗体的标记37
• 3.3 金标垫的制备37
• 3.4 试纸条与其他方法的比较37-38
• 3.5 试纸条的应用38
• 4 小结38-39
• 结论39-40
• 参考文献40-44
• Abstract44-46
• 致谢46

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本文编号：581850