非编码小RNA RyhB-1与IsrE在肠炎沙门氏菌致病性上的相互作用研究

发布时间：2017-08-01 09:34

  本文关键词：非编码小RNA RyhB-1与IsrE在肠炎沙门氏菌致病性上的相互作用研究

  更多相关文章： 肠炎沙门氏菌 ryhB-1 isrE 毒力 致病性

【摘要】：RyhB是一种大小为90bp左右的细菌非编码小RNA,可在转录后水平调节基因的表达。前人研究表明存在于鼠伤寒沙门氏菌和霍乱弧菌中的两种RyhB同源物RyhB-1与IsrE可调控细菌生物膜形成、趋化性和耐酸性。本研究对肠炎沙门氏菌sRNA RyhB两种同源物RyhB-1与IsrE在肠炎沙门氏菌致病性上的作用,以及两种同源物能否对毒力调控发挥协同作用进行了如下的研究。1肠炎沙门氏菌50336 RyhB-1与IsrE在不同环境下表达量检测根据肠炎沙门氏菌RyhB-1与IsrE序列设计引物,利用荧光定量PCR反应检测二者在肠炎沙门氏菌不同生长时期时处于铁匮乏、模拟肠道环境、感染巨噬细胞的培养条件下的表达量,分析RyhB-1与IsrE在不同培养时期和不同培养条件时表达量的变化规律尤其是模拟宿主内环境时表达情况,结果显示,在铁匮乏条件下,对数期时,RyhB-1与IsrE的表达水平均比普通LB培养时高2倍,稳定期时,RyhB-1与IsrE的表达量分别是普通LB培养条件下的2.5倍和3倍,表明两种sRNA表达量的升高与该菌在缺铁环境中需要高效吸收铁有关,推测两种sRNA可调控铁代谢。模拟肠道环境下,对数期时RyhB-1与IsrE的表达水平与普通LB培养时相比,分别上升3.5倍和3倍,稳定期时上升1.3倍和1.5倍。与感染巨噬细胞前相比,感染1h和4h时,RyhB-1的表达水平分别上升2倍与5.5倍,IsrE的表达水平分别上升4.5倍与8.5倍。表明了RyhB-1与IsrE在受到环境变化压力下被诱导表达使表达量显著升高,IsrE的表达水平变化高于RyhB-1,推测二者均与肠炎沙门氏菌的毒力相关,但对毒力的调控方式可能不同。2肠炎沙门氏菌50336 RyhB-1与IsrE双缺失突变株及相应回补株构建本课题前期利用λ-Red同源重组系统构建了ryhB-1和isrE单基因缺失株,本研究将继续利用同源重组系统构建出ryhB-1和isr E双基因缺失株,在此基础上,分别设计含有ryhB-1和isrE序列和上下游非编码序列以及酶切位点的引物,利用pBR322表达质粒构建isrE单缺失株的回补株50336△isrE/pisrE,利用pACYC184表达质粒构建ryhB-1单缺失株的回补株50336△ryhB-1/pryhB-1,利用pBR322表达质粒和pACYC184表达质粒构建ryhB-1和isrE双缺失株的回补株50336△ryhB-1/△isrE/pryhB-1/pisrE,为进一步探索sRNA RyhB的两种同源物ryhB-1和isrE在肠炎沙门氏菌致病过程中的作用提供材料。3体内外实验分析肠炎沙门氏菌50336 RyhB-1与IsrE在致病性方面的作用通过肠炎沙门氏菌野生株50336、ryhB-1和isrE单双基因缺失株以及相应的回补株检测细菌的运动能力、生物膜形成能力、对各运动性关键基因表达量、对宿主细胞的侵袭力和黏附力、对巨噬细胞的抗吞噬力与在巨噬细胞内的存活率、对易感动物1日龄雏鸡的半数致死量,死亡率,体内细菌分布,分析RyhB-1与IsrE在调控毒力与致病性上的差异性,结果显示ryhB-1或isrE单一基因的缺失会下调这些能力,毒力减弱；ryhB-1和isrE双基因的缺失对这些能力的下调更为明显,毒力下降更为显著,表明两种sRNA均对肠炎沙门氏菌致病性具有增强作用。
【关键词】：肠炎沙门氏菌 ryhB-1 isrE 毒力 致病性
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378;S852.61
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 符号说明10-11
• 综述：沙门氏菌非编码小RNA研究进展11-25
• 1 细菌非编码小RNA研究进展11-13
• 1.1 细菌非编码小RNA的发现11-12
• 1.2 细菌非编码小RNA的特征与类型12
• 1.3 细菌非编码小RNA的生物学功能12-13
• 2 沙门氏菌非编码sRNA RyhB研究进展13-15
• 2.1 沙门氏菌非编码sRNA RyhB-1与IsrE的发现与结构特点13
• 2.2 RyhB-1与IsrE的作用机制13-14
• 2.3 RyhB-1与1srE的生物学功能14-15
• 2.3.1 RyhB-1与IsrE调控铁代谢14
• 2.3.2 RyhB-1与IsrE调控细菌致病力14-15
• 4 总结15-17
• 参考文献17-25
• 研究一 肠炎沙门氏菌50336 RyhB-1和IsrE在不同环境下表达量检测25-36
• 1 材料26-27
• 1.1 菌株与细胞系26
• 1.2 培养基和主要试剂26
• 1.3 主要仪器26-27
• 2 方法27-30
• 2.2 RyhB-1与IsrE在不同培养条件和培养时期表达量检测27-30
• 2.2.1 qRT-PCR各基因引物设计27
• 2.2.2 HD-11细胞培养与传代27
• 2.2.3 Trizol法提取RNA27-28
• 2.2.4 cDNA制备28
• 2.2.5 qRT-PCR反应28-29
• 2.2.6 RyhB-1与IsrE在铁匮乏时对数期和稳定期的表达量检测29
• 2.2.7 RyhB-1与IsrE在模拟肠道环境下对数期和稳定期的表达量检测29
• 2.2.8 RyhB-1与IsrE在感染鸡源巨噬细胞后表达量检测29-30
• 3 结果30-33
• 3.1 RyhB-1与IsrE在铁匮乏时对数期和稳定期的表达量检测30-31
• 3.2 RyhB-1与IsrE在模拟肠道环境下对数期和稳定期的表达量检测31-32
• 3.3 RyhB-1与IsrE感染巨噬细胞HD-11后表达量检测32-33
• 4 讨论33-34
• 参考文献34-36
• 研究二 肠炎沙门氏菌50336 RyhB-1与IsrE双缺失突变株及相应回补株的构建36-49
• 1 材料37-38
• 1.1 菌株与质粒37
• 1.2 培养基和主要试剂37
• 1.3 主要仪器37-38
• 2 方法38-44
• 2.1 肠炎沙门氏菌RyhB-1与IsrE双缺失突变株50336△ryhB-1/△isrE的构建38-42
• 2.1.1 PCR引物设计38
• 2.1.2 带氯霉素抗性基因的PCR产物制备与纯化38-39
• 2.1.3 感受态细胞的制备以及pKD46的转化39
• 2.1.4 Red重组酶诱导和带氯霉素抗性PCR产物片段的电转化39-40
• 2.1.5 质粒pKD46消除40
• 2.1.6 一次同源重组菌50336△ryhB-1/△isrE：：cat的PCR鉴定40-41
• 2.1.7 FLP位点专一性重组41
• 2.1.8 二次同源重组菌50336△ryhB-1/△isrE的PCR鉴定41-42
• 2.2 回补株50336△ryhB-1/pryhB-1和50336△ryhB-1/△isrE/pryhB-1/pisrE的构建42-44
• 2.2.1 回补片段PCR产物制备42
• 2.2.2 载体质粒pACYC184、质粒pBR322与PCR产物双酶切42-43
• 2.2.3 酶切产物连接与鉴定43
• 2.2.4 重组质粒电转化与回补株的构建43-44
• 3 结果44-46
• 3.1 带氯霉素抗性基因PCR产物鉴定44
• 3.2 一次同源重组菌50336△ryhB-1/△isrE：：cat与二次同源重组菌50336△ryhB-1/△isrE鉴定44-45
• 3.3 双缺失株50336△ryhB-1/△isrE序列分析鉴定45-46
• 3.4 回补株50336△ryhB-1/pryhB-1和50336△ryhB-1/△isrE/pryhB-1/pisrE鉴定46
• 4 讨论46-47
• 参考文献47-49
• 研究三 体内外实验分析肠炎沙门氏菌50336 RyhB-1和IsrE在致病性方面的作用49-74
• 1 材料50-51
• 1.1 菌株、细胞系与实验动物50
• 1.2 培养基和主要试剂50-51
• 1.3 主要仪器51
• 2 方法51-56
• 2.1 RyhB-1与IsrE相关各菌株生长曲线测定51
• 2.2 RyhB-1与IsrE对肠炎沙门氏菌运动能力的影响51-52
• 2.2.1 半固体运动性实验51
• 2.2.2 RyhB-1与IsrE对运动性相关基因的qRT-PCR反应51-52
• 2.3 RyhB-1与IsrE对肠炎沙门氏菌生物膜形成能力的影响52-53
• 2.3.1 结晶紫染色法定性测定野生株、缺失株与回补株的生物膜形成能力52
• 2.3.2 结晶紫染色法定量测定野生株、缺失株与回补株的生物膜形成能力52-53
• 2.4 RyhB-1与IsrE对肠上皮细胞Caco-2侵袭力的影响53
• 2.5 RyhB-1与IsrE对肠上皮细胞Caco-2黏附力的影响53-54
• 2.6 RyhB-1与IsrE对鸡源巨噬细胞HD-11抗吞噬力测定54-55
• 2.7 RyhB-1与IsrE在鸡源巨噬细胞HD-11内存活率测定55
• 2.8 RyhB-1 and IsrE对易感动物毒力的影响55-56
• 2.8.1 对一日龄雏鸡攻毒后LD50和死亡率测定55-56
• 2.8.2 临床变化以及病理解剖变化56
• 2.8.3 攻毒组雏鸡体内细菌的分离与鉴定56
• 2.8.4 攻毒组雏鸡体内细菌分布检测56
• 3 结果56-71
• 3.1 生长曲线测定结果56-58
• 3.2 RyhB-1与IsrE对肠炎沙门氏菌运动能力的影响58-61
• 3.2.1 半固体运动性试验结果58-59
• 3.2.2 与运动性相关的基因qRT-PCR结果59-61
• 3.3 RyhB-1与IsrE对肠炎沙门氏菌生物膜形成能力的影响61-62
• 3.3.1 RyhB-1与IsrE对肠炎沙门氏菌生物膜形成定性分析结果61
• 3.3.2 RyhB-1与IsrE对肠炎沙门氏菌生物膜形成定量分析结果61-62
• 3.4 肠上皮细胞Caco-2侵袭实验结果62-63
• 3.5 肠上皮细胞Caco-2黏附实验结果63-66
• 3.6 RyhB-1与IsrE突变株对鸡源巨噬细胞的抗吞噬力及其在巨噬细胞内细菌存活率的测定66-68
• 3.7 RyhB-1与IsrE对易感动物毒力的影响68-71
• 3.7.1 一日龄雏鸡攻毒LD50与死亡率测定结果68-69
• 3.7.2 临床变化以及病理解剖变化69
• 3.7.3 攻毒组雏鸡体内细菌分离与鉴定结果69-70
• 3.7.4 攻毒组雏鸡体内细菌分布情况70-71
• 4 讨论71-72
• 参考文献72-74
• 全文小结74-75
• 致谢75-76

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张艳红,杜元钊,吴延功;肠炎沙门氏菌快速检测方法的建立[J];中国动物检疫;2002年07期

2 黎敏英;邓树轩;;肠炎沙门氏菌感染与宿主的关系[J];畜牧与饲料科学;2009年06期

3 叶朗光;邓树轩;;肠炎沙门氏菌研究进展[J];畜牧与饲料科学;2011年02期

4 叶qP翼;;利用肠炎沙门氏菌特异性PCR检测方法对一起感染病例的诊断[J];畜牧与饲料科学;2012年Z1期

5 陆彦;吕安;赵红玉;侯晓林;吴国娟;;鸡源肠炎沙门氏菌对抗菌药物的耐药性分析[J];中国人兽共患病学报;2014年01期

6 李凯年;;肠炎沙门氏菌多重抗药性的特征[J];中国动物保健;2010年11期

7 焦新安,倪振亚,张如宽,刘秀梵;肠炎沙门氏菌鞭毛蛋白基因快速克隆和鉴定[J];江苏农学院学报;1998年03期

8 李婉丽;莫婕;蒋梦萍;胡渝珠;余洋;邓鹜远;刘青成;孙群;;鸡蛋中亚致死损伤肠炎沙门氏菌的检测增菌液优化[J];食品科学;2013年21期

9 张艳红,杜元钊,吴延功;肠炎沙门氏菌脂多糖的提取与制备[J];动物医学进展;2001年03期

10 曾庆梅;张冬冬;韩抒;司文攻;李志强;;热损伤肠炎沙门氏菌的修复方法研究[J];食品科学;2009年23期

中国重要会议论文全文数据库 前8条

1 樊世杰;郑江霞;马佳;徐桂云;;家禽中肠炎沙门氏菌特异性PCR检测技术研究[A];安全优质的家禽生产——第十五次全国家禽学术讨论会论文集[C];2011年

2 董洪燕;张小荣;潘志明;彭大新;刘秀梵;;转座子随机插入鉴定肠炎沙门氏菌生物膜形成相关基因[A];中国畜牧兽医学会2008年学术年会暨第六届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集[C];2008年

3 王亮;常维山;;鸡源性肠炎沙门氏的分离与鉴定[A];山东畜牧兽医学会禽病学专业委员会第一次学术研讨会论文集[C];2009年

4 邓树轩;程安春;汪铭书;曹平;朱德康;陈孝跃;;肠炎沙门氏菌种特异性PCR及对感染鸭快速检测的研究[A];第四届第九次全国学术研讨会暨饲料和动物源食品安全战略论坛论文集（下册）[C];2008年

5 尹念春;程安春;汪铭书;曹省艳;邓树轩;曹平;张振华;颜彬;朱德康;罗启慧;陈孝跃;;FQ-PCR检测肠炎沙门氏菌实验感染雏鸭肠道内优势菌属的动力学[A];第四届第九次全国学术研讨会暨饲料和动物源食品安全战略论坛论文集（上册）[C];2008年

6 吕殿红;翟少伦;周秀蓉;魏文康;;一株雏鸡关节源新型肠炎沙门氏菌的分离鉴定[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年

7 邓树轩;程安春;汪铭书;曹平;朱德康;陈孝跃;;特异性DNA序列建立种特异性FQ-PCR快速检测肠炎沙门氏菌[A];第四届第九次全国学术研讨会暨饲料和动物源食品安全战略论坛论文集（下册）[C];2008年

8 尹念春;程安春;汪铭书;曹省艳;邓树轩;曹平;张振华;颜彬;朱德康;罗启慧;陈孝跃;;FQ-PCR检测肠炎沙门氏菌实验感染雏鸭肠道的肠球菌数量变化规律[A];第四届第九次全国学术研讨会暨饲料和动物源食品安全战略论坛论文集（上册）[C];2008年

中国重要报纸全文数据库 前1条

1 刘正午;夏季小心肠炎，，防治须重益肠[N];医药经济报;2013年

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 陆广富;肠炎沙门氏菌的分离鉴定与特异性检测方法的建立[D];扬州大学;2010年

2 朱春红;肠炎沙门氏菌SEF14菌毛功能探索[D];扬州大学;2010年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 凡文磊;利用RNA-seq技术挖掘鸡肠炎沙门氏菌抗性相关功能基因[D];中国农业科学院;2015年

2 陈铖;肠炎沙门氏菌不同感染途径对雏鸡的致病性及其对药物敏感性实验[D];福建农林大学;2016年

3 史冰田;肠炎沙门氏菌FliC蛋白对鸡PBMCs分泌细胞因子的影响研究[D];中国农业科学院;2016年

4 倪杰;非编码小RNA RyhB-1与IsrE在肠炎沙门氏菌致病性上的相互作用研究[D];扬州大学;2016年

5 张艳红;单抗竞争ELISA快速检测肠炎沙门氏菌方法的建立[D];山西农业大学;2001年

6 曹省艳;肠炎沙门氏菌感染对鸭肠道菌群结构和呼吸道6种菌数量的影响[D];四川农业大学;2008年

7 汪敏;肠炎沙门氏菌实验性感染雏鸡的研究[D];西南大学;2009年

8 齐玉凯;肠炎沙门氏菌感染引起的白来航蛋鸡脾脏全基因组表达谱分析[D];山东农业大学;2013年

9 周罗雄;乳酸菌对肉鸡肠道中肠炎沙门氏菌的抑菌作用研究[D];西北农林科技大学;2014年

10 王延昭;利用免疫磁珠技术富集肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌[D];华中农业大学;2010年

本文编号：603635