AIV鉴定、扩增及测序引物的优化和应用及H9N2亚型AIV对哺乳动物潜在危害的分子基础研究

发布时间：2017-08-06 21:00

  本文关键词：AIV鉴定、扩增及测序引物的优化和应用及H9N2亚型AIV对哺乳动物潜在危害的分子基础研究

  更多相关文章： 禽流感病毒 引物的优化和应用 鼠致病性 继代感染 致病机理

【摘要】：亚型鉴定是禽流感病毒研究的一项基础而重要的工作。由于禽流感病毒的不断进化,给禽流感病毒的诊断工作带来了新的问题。目前常用的亚型鉴定方法是RT-PCR反应,而引物决定RT-PCR反应的特异性和灵敏性。为适应禽流感病毒的变异,RT-PCR反应中使用的引物需要不断的更新。因H5、H7、H9、H3、H4和H6,N1、N2、N6、N8及N9为目前流感病毒的优势亚型,根据本实验室已有的及GeneBank中的序列,进行比对,使用Primer5软件设计这些亚型的HA和NA的通用扩增引物及特异性的鉴定引物。禽流感病毒的内部基因相对比较保守,下载各亚型禽流感病毒的六个内部基因序列,比对后,设计通用引物。在测序方面,采用一对M13F/M13R引物替代之前的分节段测序引物。采用优化的引物对2013-2015年边境省份的禽流感流行病学调查中分离到的41株禽流感病毒进行了亚型鉴定和序列测定。包括5株H5N6亚型、2株H5N1亚型、10株H3N2亚型及24株H9N2亚型。对41株病毒株进行全基因组测序分析发现:5株H5N6亚型禽流感病毒集中于clade2.3.4.4分支;2株H5N1亚型禽流感病毒属于clade2.3.2.1c分支;10株H3N2亚型禽流感病毒均处于欧亚禽源病毒分支;24株H9N2亚型禽流感病毒都分布在BJ/1/94亚群。关键氨基酸位点分析发现:所有H5亚型病毒HA蛋白裂解位点均有多个连续的碱性氨基酸,符合HPAIV的特征;所有H3和H9亚型病毒HA蛋白裂解位点均不含有多个连续的碱性氨基酸,符合LPAIV的特征。同源性分析发现:2株从虎体内分离到的H5N1亚型禽流感病毒为重组病毒,其内部基因由H9N2亚型禽流感病毒提供。H9N2禽流感病毒为感染人的流感病毒,如1997年的香港H5N1禽流感病毒、2013年的H7N9及H10N8禽流感病毒,这些新型重组病毒提供了内部基因片段,并在新型禽流感病毒的产生中起重要作用。H9N2亚型禽流感病毒在我国流行甚广,本实验室近年来从哺乳动物体内分离到了多株H9N2亚型禽流感病毒。为探究H9N2亚型禽流感病毒对哺乳动物的致病机制,选取Civet/GX/S9/13(H9N2)病毒株在小鼠上进行了致病性和适应性研究。原代Civet/GX/S9/13(H9N2)仅在BALB/C鼠的肺脏和鼻甲骨中呈较低程度的复制,对小鼠不致死,呈低致病性。将该病毒在BALB/C鼠体内继代感染,其在小鼠的肺脏和鼻甲骨中复制滴度增高,第8代病毒致死BALB/C鼠,对BALB/C鼠的致病性增强。分析继代感染病毒的氨基酸位点,发现只有PB2蛋白上有三个氨基酸位点发生了突变。在上述研究的基础上,以Civet/GX/S9/13(H9N2)为模式病毒,利用反向遗传技术开展了H9N2亚型禽流感病毒对哺乳动物致病性差异的分子机制研究。建立了模式病毒的反向遗传操作系统,通过鸡胚感染和小鼠感染实验证实了救获的亲本病毒保持了野生型病毒原有的生物学特性。
【关键词】：禽流感病毒 引物的优化和应用 鼠致病性 继代感染 致病机理
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 英文缩略表11-12
• 第一章 引言12-21
• 1.1 禽流感病毒简介12-13
• 1.2 禽流感病毒的流行及公共卫生学意义13
• 1.3 禽流感病毒致病性的分子基础13-17
• 1.3.1 HA14
• 1.3.2 NA14-15
• 1.3.3 PB215-16
• 1.3.4 PB1-F216
• 1.3.5 NS116-17
• 1.4 禽流感病毒的变异17-19
• 1.4.1 禽流感病毒的变异机制17
• 1.4.2 H5N1亚型禽流感病毒的变异17-18
• 1.4.3 H9N2亚型禽流感病毒的变异18
• 1.4.4 H7亚型禽流感病毒的变异18-19
• 1.5 禽流感病毒的检测19
• 1.5.1 禽流感病毒的检测方法19
• 1.5.2 禽流感病毒的引物19
• 1.6 反向遗传操作技术19-20
• 1.7 本研究的目的意义20-21
• 第二章 AIV分子诊断引物的优化21-26
• 2.1 材料21
• 2.1.1 实验用软件21
• 2.1.2 实验用毒株21
• 2.1.3 实验用试剂21
• 2.2 方法21-22
• 2.2.1 参考序列21
• 2.2.2 引物设计21
• 2.2.3 RT-PCR扩增21-22
• 2.3 结果22-25
• 2.3.1 鉴定引物的优化22-23
• 2.3.2 HA基因扩增引物的优化23
• 2.3.3 NA基因扩增引物的优化23-24
• 2.3.4 内部基因扩增引物的优化24-25
• 2.3.5 测序引物的优化25
• 2.4 讨论25-26
• 第三章 AIV分子诊断引物的应用26-55
• 3.1 材料26
• 3.1.1 样品26
• 3.1.2 实验用鸡胚26
• 3.1.3 主要试剂及仪器26
• 3.1.4 引物与参考序列26
• 3.2 方法26-29
• 3.2.1 病毒RNA的提取26-27
• 3.2.2 反转录合成cDNA27
• 3.2.3 聚合酶链式反应（PCR）扩增病毒各节段27
• 3.2.4 PCR产物的鉴定与纯化27-28
• 3.2.5 各节段的核酸序列测定28-29
• 3.2.6 各节段序列的拼接和进化树构建29
• 3.3 结果29-53
• 3.3.1 病毒分离及亚型鉴定29-30
• 3.3.2 HA基因的遗传演化分析30-38
• 3.3.3 NA基因的遗传演化分析38-43
• 3.3.4 内部基因的遗传演化分析43-53
• 3.4 讨论53-55
• 第四章 H9N2 AIV对哺乳动物致病机理研究55-64
• 4.1 材料55-56
• 4.1.1 病毒株55
• 4.1.2 SPF鸡胚及试验动物55
• 4.1.3 试剂55
• 4.1.4 生物安全性55
• 4.1.5 引物55
• 4.1.6 PBD质粒载体55-56
• 4.2 方法56-58
• 4.2.1 鸡胚半数感染量（EID50）测定56
• 4.2.2 H9N2亚型禽流感原代病毒对BALB/c鼠的致病性试验56-57
• 4.2.3 H9N2亚型禽流感病毒在BALB/c鼠体内继代感染57
• 4.2.4 H9N2亚型禽流感病毒重组质粒的构建57-58
• 4.2.5 H9N2亚型禽流感病毒拯救及救获病毒的鉴定58
• 4.3 结果58-62
• 4.3.1 同源性比较58-59
• 4.3.2 H9N2 亚型禽流感病毒原代病毒对 BALB/c 鼠的致病性试验结果59-60
• 4.3.3 H9N2 亚型禽流感病毒在 BALB/c 鼠体内继代感染结果60-62
• 4.3.4 H9N2 亚型禽流感病毒在 BALB/c 鼠体内继代感染之后氨基酸差异62
• 4.3.5 H9N2 禽流感病毒拯救及鉴定结果62
• 4.4 讨论62-64
• 全文结论64-65
• 参考文献65-70
• 致谢70-71
• 作者简介71

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4 徐瑛;珍爱生命、关注社会、抗击禽流感——7年级生物学课堂实录[J];生物学通报;2004年04期

5 ;低温下的禽流感病毒能存活更长时间[J];饲料与畜牧;2004年06期

6 魏秀俭,李晓鹏;禽流感病毒概述[J];聊城大学学报(自然科学版);2004年03期

7 ;科学与禽流感之间的战争[J];科技资讯;2004年05期

8 ;我国禽流感病毒研究新发现[J];中国牧业通讯;2005年19期

9 范宗理;鸭子可扩大禽流感病毒传播的危险性[J];自然杂志;2005年03期

10 然悠;直面禽流感[J];苏南科技开发;2005年11期

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1 孙晓林;;禽流感和公共卫生[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分第12次暨中国动物病理生理学专业委员会第11次学术讨论会论文集[C];2003年

2 何义林;叶冬青;;禽流感病毒对人类感染机制的研究进展[A];第二届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2008年

3 春阳;李东;;再论“以科学发展观应对禽流感事件”——评禽流感病毒变种两次恐慌论[A];首届中国黄羽肉鸡行业发展大会会刊[C];2008年

4 邓洁丽;段明星;俞初一;江龙;;聚联乙炔有序组装体在识别禽流感病毒方面的应用研究[A];中国化学会第十二届胶体与界面化学会议论文摘要集[C];2009年

5 孙恩泽;谢敏;赵海粟;黄碧海;刘书琳;张万坡;张志凌;王汉中;庞代文;;量子点标记禽流感病毒[A];第六届全国化学生物学学术会议论文摘要集[C];2009年

6 黄志坚;陈强;李清禄;王寿昆;江和基;;不同消毒剂对禽流感病毒的杀灭试验[A];福建省科协第八届学术年会分会场“转变饲养方式，促进海西畜牧业和谐发展”学术年会论文集[C];2008年

7 周祖华;张敏;程礼明;徐彬;沈彩信;;禽流感流行趋势分析[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年

8 王志宇;张议文;刘桂林;;禽流感病毒的分子生物学研究进展[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年

9 刘迎芳;饶子和;;禽流感病毒(H5N1)RNA聚合酶PA亚基相关三维晶体结构与功能分析[A];第十一次中国生物物理学术大会暨第九届全国会员代表大会摘要集[C];2009年

10 韦婷;胡杰;兰彬;陆文俊;苏凯;覃芳芸;;广西暴发中低毒力禽流感情况报告[A];中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会论文集[C];2000年

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1 农业部动物疫病诊断与流行病学中心主任 崔尚金 博士;候鸟发生禽流感给我们的警示[N];中国畜牧兽医报;2005年

2 莫书莹;世卫警告：禽流感或大流行全球经济应警惕[N];第一财经日报;2005年

3 本报记者 魏红欣;禽流感“啄”痛全球经济[N];国际金融报;2005年

4 本报记者　许凯;狙击禽流感：一场鸟与人的战争[N];国际金融报;2005年

5 新华社记者　杨爱国;防控禽流感需要加强国际合作[N];光明日报;2005年

6 李杨;禽流感疫情不会长期影响农产品期价[N];金融时报;2005年

7 罗政、夏文辉;香港强化防止禽流感措施[N];人民日报海外版;2004年

8 本报记者　张向永　赵秀芹;禽流感让全世界手牵手[N];市场报;2005年

9 ;禽流感病毒能否绝迹？[N];中国石油报;2004年

10 何源;严防禽流感从境外传入我国[N];中国食品质量报;2005年

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1 邹镇;H5N1型禽流感病毒和甲型H1N1流感病毒致急性呼吸损伤的机理研究[D];北京协和医学院;2012年

2 赵蔚;基于磁分离和荧光量子点标记的高灵敏禽流感病毒检测[D];武汉大学;2012年

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5 樊兆斌;野鸟源禽流感病毒(AIV)分离株的遗传进化及其致病性研究[D];东北林业大学;2014年

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7 孟芳;H9N2亚型禽流感HA基因演化及其内部基因在H5N2亚型流感病毒演化中的作用[D];山东农业大学;2015年

8 韩雯;山东地区H9N2禽流感流行病学调查及流行毒株分子生物学检测[D];山东农业大学;2014年

9 查国飞;昆虫细胞表达重组H5亚型禽流感HA蛋白及其免疫原性研究[D];安徽农业大学;2014年

10 侯群;新疆青格达湖湿地鸟类中H5、H7亚型AIV和NDV流行病学监测[D];石河子大学;2015年

，

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