猪流行性腹泻病毒S1蛋白间接ELISA方法的建立与应用及卵黄抗体的制备
本文关键词：猪流行性腹泻病毒S1蛋白间接ELISA方法的建立与应用及卵黄抗体的制备
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【摘要】：猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种高度接触性的消化道传染病,主要引起病猪呕吐、急性水样腹泻、脱水以及仔猪的高死亡率等症状。各个年龄阶段的猪群均可造成PED感染,传播速度快,仔猪的发病率、死亡率很高,给养猪业造成巨大的经济损失。近年来PED的流行趋势不断扩大,已经在世界范围内造成严重影响。为了更好地防治该病,本研究分离到一株PEDV病毒(PEDV-HN/01);以截短表达的S1蛋白建立了具有良好特异性和敏感性的间接ELISA方法;制备了具有良好中和效果的卵黄抗体。本研究分为三部分:1猪流行性腹泻病毒的分离和鉴定本研究通过对采集的病料接种到含终浓度6ug/ml胰酶的Vero细胞上进行分离传代,盲传到4代后出现局灶性细胞病变。通过对S1基因序列分析,该毒株与经典株CV777相比发生了变异,与美国、韩国毒株关系较远,同源性分别为91.9㳠、91.8㳠。该病毒能使Vero细胞产生空泡、融合病变,对第20代病毒TCID50测定结果为10-4.3/0.1ml。将病毒的细胞培养产物应用RT-PCR、间接免疫荧光、动物回归试验进行鉴定。证明所分离到的病毒为PEDV,并将其命名为PEDV-HN/01。2 PEDV S1基因截短克隆表达及间接ELISA方法的建立本试验以PEDV-HN/01株PMD-18T-S1质粒为模板,设计引物,成功地克隆出S1截短基因并连接到原核表达载体PET-32a(+)中,构建了重组表达质粒PET-32a-t S1,经测序鉴定正确后,转化至感受态细胞BL21(DE3)中,并进行IPTG诱导表达。对重组的表达蛋白用镍离子亲和层析法纯化,Western-blotting检测表明:表达的S1蛋白能与PEDV阳性血清发生特异性的免疫反应,表明原核表达的S1蛋白具有良好的反应原性。以原核表达的重组S1蛋白作为检测抗原,优化ELISA反应条件,建立了PEDV间接ELISA抗体检测方法。其反应条件为:抗原最佳包被浓度为5.13μg/m L,血清样品最佳稀释度为1:100,包被时间为4℃作用12h,1.0%BSA 37℃封闭1h,二抗1:4000稀释,37℃作用1h,底物液显色时间为10 min,抗体临界值为D450 nm≥0.338判为阳性,D450 nm0.338判为阴性,该方法特异性强,该方法仅对PEDV血清检测为阳性,对猪传染性胃肠炎、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒感染猪的阳性血清检测结果均为阴性;其批内和批间重复性试验的变异系数为1.06%~6.81%。在敏感性试验中,当阳性血清稀释至6400倍时,虽然显色后靠肉眼观察难以判断阴、阳性结果,但酶标仪仍可以检测出为阳性。对50份疑似猪流行性腹泻血清样品进行检测,该方法与商品试剂盒的符合率为94.0%。选20份用建立的ELISA方法检测的阳性血清进行病毒中和试验,结果表明两者具有较好的相关性。采用建立的ELISA方法检测了河南、河北、安徽、山东地区临床样品,抗体阳性达到42.00%。结果表明建立的以重组S1蛋白为包被抗原检测PEDV血清抗体的方法可以用于PEDV抗体检测及疫苗免疫效果评价。3 PEDV卵黄抗体的制备本试验利用分离到的PEDV-HN/01细胞毒种,成功制备3000ml Vero细胞病毒培养物,用超滤浓缩仪器进行浓缩、过滤。利用凝胶层析方法纯化超滤后的病毒,-80℃保存,对收集的病毒液进行SDS-PAGE分析。结果显示细胞毒里的小牛血清已被除去,表明该方法具有良好的纯化效果。将纯化后细胞毒与蜂胶佐剂按比例混合,作为免疫抗原,免疫产蛋鸡,每隔两周免疫,共免疫3次,定期利用ELISA方法检测抗体效价水平变化趋势。琼脂扩散试验抗体效价最高达到最高时,收集并纯化卵黄抗体(Ig Y),SDS-PAGE结果分析纯化效果较好。将卵黄抗体与CV777疫苗毒进行中和试验,结果测得体外中和抗体的效价为PD50=10-2.1/0.1ml。结果表明本研究纯化浓缩后的病毒具有良好的免疫原性,作为免疫抗原免疫产生的卵黄抗体具有较高的抗体效价,为进一步研制猪流行性腹泻卵黄抗体生物制剂奠定了基础。
【关键词】：猪流行性腹泻病毒 分离鉴定 S1基因 间接ELISA 卵黄抗体
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：
- 符号及缩略词4-8
- 中文摘要8-10
- ABSTRACT10-12
- 1 前言12-26
- 1.1 猪流行性腹泻的研究进展12-21
- 1.1.1 PEDV的形态结构和理化特性12-13
- 1.1.2 PEDV的分子生物学特点13-15
- 1.1.3 猪流行性腹泻流行病学15-17
- 1.1.4 PEDV的培养特性17
- 1.1.5 猪流行性腹泻临床症状和病理变化17-18
- 1.1.6 猪流行性腹泻病毒诊断检测方法18-20
- 1.1.7 疫苗开发进展20-21
- 1.2 卵黄抗体的研究进展21-24
- 1.2.1 卵黄抗体的形成21-22
- 1.2.2 卵黄抗体的结构22
- 1.2.3 卵黄抗体的理化特性22-23
- 1.2.4 卵黄抗体的优势23
- 1.2.5 卵黄抗体在猪生产上的应用23
- 1.2.6 卵黄抗体在猪流行性腹泻上的应用23-24
- 1.3 本研究的目的和意义24-26
- 2 材料与方法26-44
- 2.1 猪流行性腹泻病毒的分离鉴定材料与方法26-33
- 2.1.1 材料26-27
- 2.1.2 方法27-33
- 2.2 猪流行性腹泻重组S蛋白间接ELISA检测方法的建立与应用的材料与方法33-40
- 2.2.1 材料33-35
- 2.2.2 方法35-40
- 2.3 猪流行性腹泻卵黄抗体的制备的材料与方法40-44
- 2.3.1 材料40-41
- 2.3.2 方法41-44
- 3 结果与分析44-65
- 3.1 猪流行性腹泻病毒的分离鉴定结果44-50
- 3.1.1 病毒分离结果44
- 3.1.2 S1基因序列分析44-47
- 3.1.3 RT-PCR鉴定结果47-48
- 3.1.4 Vero细胞胰酶适应性结果48
- 3.1.5 细胞病变结果48-49
- 3.1.6 TCID50的测定结果49
- 3.1.7 间接免疫荧光实验49-50
- 3.1.8 动物回归试验50
- 3.2 猪流行性腹泻重组S蛋白间接ELISA检测方法的建立与应用结果50-60
- 3.2.1 PEDV tS1截短基因扩增结果50-51
- 3.2.2 pMD18-T-tS1截短重组质粒双酶切鉴定51
- 3.2.3 pET-32a-tS1截短表达质粒双酶切鉴定51-52
- 3.2.4 重组S1蛋白的诱导表达和纯化52-53
- 3.2.5 重组的S1蛋白Western-blotting分析53-54
- 3.2.6 间接ELISA条件优化结果54-56
- 3.2.7 间接ELISA判断标准的确定56
- 3.2.8 特异性试验56-57
- 3.2.9 敏感性试验57
- 3.2.10 重复性试验57-58
- 3.2.11 稳定性试验58
- 3.2.12 符合性试验58-60
- 3.2.13 临床检测结果60
- 3.3 猪流行性腹泻卵黄抗体的制备结果60-65
- 3.3.1 Vero细胞接毒变化60
- 3.3.2 病毒纯化鉴定60-61
- 3.3.3 卵黄抗体及血清效价水平检测61-62
- 3.3.4 卵黄抗体SDS-PAGE分析62
- 3.3.5 卵黄抗体浓度的测定及效价检测62
- 3.3.6 无菌检验结果62
- 3.3.7 卵黄抗体的中和试验62-64
- 3.3.8 卵黄抗体中和效价与ELISA检测结果比较64-65
- 4 讨论65-68
- 4.1 猪流行性腹泻病毒的分离鉴定65-66
- 4.2 猪流行性腹泻重组S1蛋白间接ELISA检测方法的建立与应用66-67
- 4.3 猪流行性腹泻卵黄抗体的制备67-68
- 5 结论68-69
- 6 参考文献69-77
- 7 致谢77-78
- 8 攻读硕士期间发表论文情况78
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