马红球菌病血清学与病原学检测方法的建立及其流行病学调查

发布时间：2017-08-12 22:29

  本文关键词：马红球菌病血清学与病原学检测方法的建立及其流行病学调查

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【摘要】：马红球菌(Rhodococcus equi)是马群聚居地常见的一种存在于土壤中的兼性细胞内寄生的革兰氏阳性球杆菌,可导致马驹亚急性或慢性化脓性支气管肺炎和广泛性肺部脓肿。马红球菌病致死率可达80%以上,可对马场乃至马业造成严重的经济损失。到目前为止,我国R.equi的报导几乎为零,缺乏标准的病原以及血清流行病学调查方法。最近报导,R.equi毒力相关脂蛋白A(VapA)是唯一的与细菌毒力相关的膜表面脂蛋白,可作为致病性R.equi的标志性抗原。因此,本研究通过构建表达VapA重组蛋白(rVapA),建立了检测致病性R.equi血清抗体的间接ELISA检测方法以及检测土壤中致病性与非致病性R.equi的菌落印记方法,并对我国马群及马聚居地R.equi进行了流行病学调查,为我国马红球菌病的防治提供技术支持、数据支撑和理论基础。首先,本研究选用pMAL-c5x原核表达体系,通过表达条件优化,融合表达了可溶性rVapA,经WB验证,其具有良好的反应原性。其次,以纯化的rVap A作为包被抗原,经条件优化,构建了致病性R.equi血清抗体间接ELISA检测方法,阳性临界值为0.370。经特异性、重复性及敏感性试验,结果表明,其与H3N8马流感、马鼻肺炎、马传染性贫血抗血清无交叉反应,且批内与批间变异系数均小于15%,具有较好的特异性、重复性和敏感性。采用该方法,首次对我国部分地区马匹进行R.equi血清流行病学调查。结果表明,致病性R.equi血清抗体总体阳性率高达53.93%,且抗体水平呈显著的地区性差异,存在品种、性别和季节特点,而与年龄无关。最后,本研究使用兔抗非致病性R.equi多抗以及兔抗致病性R.equi VapA蛋白多抗,并通过条件优化,构建了可用于R.equi检测并区分致病性与非致病性R.equi的菌落印记检测方法。与细菌分离鉴定及R.equi PCR鉴定方法相比,该检测方法具有敏感性高、特异性好、检测快速的优点。采用该方法对我国部分地区马场土壤中R.equi进行流行病学调查。结果表明,R.equi在马场土壤中的分布与马匹活动有关,所有土壤样本采集马场均可分离鉴定出R.equi,土壤中R.equi的平均阳性率为43.21%,未发现致病性R.equi。本研究获得融合表达rVapA蛋白,为R.equi致病机制研究提供材料基础,并为马红球菌病的诊疗方法的建立提供物质基础。本研究建立的间接ELISA检测方法以及菌落印记检测方法为马红球菌病流行病学调查提供技术支撑。本研究获得的全国马匹R.equi血清学及马场R.equi流行病学信息,填补了我国R.equi流行情况空白的现状,为我国R.equi的防控提供基础数据。
【关键词】：马红球菌 毒力相关脂蛋白A 间接ELISA 菌落印记 流行病学调查
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.21
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-14
• 前言14-20
• 1 马红球菌病概述14-15
• 1.1 R. equi的流行概况14-15
• 1.2 马红球菌病的临床症状及诊断15
• 1.3 马红球菌病的防治15
• 2 R. equi毒力相关蛋白研究概况15-18
• 2.1 致病性与非致病性R. equi的区别16
• 2.2 致病性R. equi毒力相关蛋白概述16-17
• 2.3 毒力相关蛋白Vap A的研究进展17-18
• 3 马红球菌病流行病学调查研究进展18-19
• 3.1 马红球菌病的病原学调查情况18
• 3.2 马红球菌病的血清学调查概况18-19
• 4 本研究的目的意义19-20
• 第一部分 马红球菌毒力相关蛋白Vap A的表达与纯化20-39
• 1 材料20-23
• 1.1 菌种与质粒20
• 1.2 主要试剂及耗材20
• 1.3 主要溶液的配置20-22
• 1.4 主要仪器及设备22-23
• 2 方法23-31
• 2.1 R. equi的复苏与培养23
• 2.2 引物设计23-24
• 2.3 Vap A基因的PCR扩增与克隆24-28
• 2.3.1 Vap A基因的PCR扩增24
• 2.3.2 Vap A基因PCR产物的回收纯化24-25
• 2.3.3 Vap A基因PCR产物与p Zero Back/blunt vector的连接25-26
• 2.3.4 连接产物转化E.coli DH5α 感受态细胞26
• 2.3.5 可疑菌落的筛选26
• 2.3.6 重组质粒p Zero Back-Vap A的提取26-27
• 2.3.7 重组质粒p Zero Back-Vap A的双酶切与测序鉴定27-28
• 2.4 原核表达重组质粒p MAL-Vap A的构建与鉴定28
• 2.5 可溶性重组蛋白r Vap A的表达及最佳诱导条件的确定28-29
• 2.5.1 IPTG诱导温度的确定28-29
• 2.5.2 IPTG诱导时间的确定29
• 2.5.3 IPTG诱导浓度的确定29
• 2.6 重组蛋白r Vap A的SDS-PAGE分析29-30
• 2.7 可溶性重组蛋白r Vap A的非变性纯化30-31
• 2.7.1 蛋白粗提30
• 2.7.2 r Vap A的亲和层析30-31
• 2.8 重组蛋白r Vap A的抗原性分析31
• 3 结果31-36
• 3.1 Vap A基因的PCR扩增31-32
• 3.2 重组质粒p Zero Back-Vap A的鉴定32-33
• 3.3 重组质粒p MAL-Vap A的鉴定33
• 3.4 重组蛋白的表达条件优化33-36
• 3.4.1 重组蛋白的诱导表达以及最佳IPTG诱导温度的确定33-34
• 3.4.2 最佳IPTG诱导浓度与时间的确定34-35
• 3.4.3 重组蛋白的纯化35-36
• 3.5 重组蛋白r Vap A的抗原性分析36
• 4 讨论36-38
• 4.1 重组蛋白r Vap A中MBP的作用37
• 4.2 重组蛋白r Vap A的诱导表达与纯化37-38
• 5 结论38-39
• 第二部分 马红球菌病抗体间接ELISA检测方法的建立及其血清流行病学调查39-57
• 1 材料39
• 1.1 参比血清及主要试剂材料39
• 1.2 主要溶液的配制39
• 2 方法39-42
• 2.1 抗原包被浓度及血清最佳稀释度的确定40
• 2.2 酶标二抗最佳工作浓度的确定40
• 2.3 封闭液的选择40
• 2.4 ELISA临界值的确定40
• 2.5 重复性试验40
• 2.6 特异性试验40-41
• 2.7 R. equi血清流行病学调查41-42
• 2.7.1 马血清样本的采集41
• 2.7.2 马血清样本的检测41
• 2.7.3 统计学分析41-42
• 3 结果42-53
• 3.1 抗原包被浓度及血清最佳稀释度的确定42-43
• 3.2 酶标二抗最佳工作浓度的确定43-44
• 3.3 封闭液的选择44
• 3.4 ELISA临界值的确定44-45
• 3.5 重复性试验45
• 3.6 特异性试验45-46
• 3.7 R. equi血清流行病学调查46-53
• 3.7.1 马匹致病性R. equi血清抗体阳性率46-48
• 3.7.2 致病性R. equi血清抗体水平的地区差异48-49
• 3.7.3 马匹致病性R. equi血清抗体水平的种间差异49-50
• 3.7.4 马匹致病性R. equi血清抗体水平的性别差异50-51
• 3.7.5 致病性R. equi血清抗体水平的季节差异51-52
• 3.7.6 致病性R. equi血清抗体水平与马匹年龄的相关性分析52-53
• 4 讨论53-56
• 4.1 R. equi间接ELISA检测方法的建立53-54
• 4.2 血清流行病学调查54-56
• 4.2.1 我国致病性R. equi血清抗体阳性率与世界各地区的比较54
• 4.2.2 我国地区间致病性R. equi血清抗体水平差异的分析54-55
• 4.2.3 我国马匹致病性R. equi血清抗体水平的季节特点55
• 4.2.4 我国马匹致病性R. equi血清抗体水平的性别特点55-56
• 4.2.5 我国马匹致病性R. equi血清抗体水平的品种特点56
• 4.2.6 我国马匹致病性R. equi血清抗体水平的年龄特点56
• 5 结论56-57
• 第三部分 马红球菌菌落印记检测方法的建立及其病原流行病学调查57-77
• 1 材料57-58
• 1.1 菌株及主要试剂材料57
• 1.2 实验动物57
• 1.3 引物57
• 1.4 主要溶液的配制57-58
• 2 方法58-64
• 2.1 R. equi的常规分离与细菌生化鉴定58-59
• 2.2 R. equi的PCR鉴定59
• 2.3 16S r RNA测序鉴定59
• 2.4 R. equi菌落印记检测方法的建立59-62
• 2.4.1 多克隆抗体的制备59-60
• 2.4.2 阳性样本的处理及细菌培养60
• 2.4.3 菌落印记法反应条件的优化60-61
• 2.4.4 特异性检测61-62
• 2.4.5 灵敏度检测62
• 2.5 R. equi流行病学调查62-64
• 2.5.1 土壤样本的采集62-63
• 2.5.2 土壤样本的分离鉴定63-64
• 2.5.3 马匹各活动区域R. equi分布情况分析64
• 3 结果64-73
• 3.1 致病性与非致病性R. equi的培养特性及生化特征64
• 3.2 R. equi的PCR鉴定64-65
• 3.3 土壤选择性培养分离菌株的 16S r RNA测序鉴定65
• 3.4 R. equi菌落印记检测方法的建立65-69
• 3.4.1 多克隆抗体的制备65-66
• 3.4.2 菌落印记法反应条件的优化66-67
• 3.4.3 菌落印记法检测鉴定标准的确定67-68
• 3.4.4 特异性检测68-69
• 3.5 R. equi的PCR鉴定法与菌落印记法的灵敏度比较69-70
• 3.6 R. equi病原流行病学调查70-73
• 3.6.1 R. equi PCR鉴定法70-71
• 3.6.2 R. equi菌落印记检测方法71
• 3.6.3 R. equi PCR鉴定法与菌落印记法的比较71-72
• 3.6.4 马场各活动区域土壤R. equi分布情况分析72-73
• 4 讨论73-76
• 4.1 常规R. equi分离鉴定、16S r RNA测序鉴定以及PCR鉴定73-74
• 4.2 R. equi菌落印记检测方法74
• 4.3 R. equi流行病学调查74-75
• 4.4 R. equi病原学与血清学调查结果比对75-76
• 5 结论76-77
• 全文总结77-78
• 致谢78-79
• 参考文献79-85
• 附录I 硕士期间研究成果85-86
• 附录II 16SrRNA测序鉴定菌株86-90

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 龚凤平;孙凌霜;鱼海琼;林志雄;李守军;;马红球菌VapA蛋白的表达及其间接ELISA检测方法的建立[J];中国预防兽医学报;2016年03期

2 蒙志好;苏凌松;;马红球菌病研究进展[J];内科;2009年03期

3 丁壮;Shinji TAKAI;Hiroo MADARAME;常爽;黄海楠;霍晓伟;高明华;谭忠田;高双成;Fumiko HATORI;Yukako SASAKI;Tsutomu KAKUDA;Shiro TSUBAKI;;中国内蒙自治区马饲育环境土壤中马红球菌的分布(英文)[J];中国兽医学报;2008年01期

4 刘文强;贾玉萍;赵宏坤;;16 S rRNA在细菌分类鉴定研究中的应用[J];动物医学进展;2006年11期

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本文编号：663991