青藏高原土壤中产植酸酵微生物的筛选及酶学特性研究

发布时间：2017-08-13 08:24

  本文关键词：青藏高原土壤中产植酸酵微生物的筛选及酶学特性研究

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【摘要】：植酸酶是一类催化植酸盐水解为无机磷酸盐和肌醇的酶类,作为一种新型饲料添加剂,在动物营养及环境保护等领域具有很大的应用潜力。在单胃动物饲料中加入微生物源植酸酶不仅能有效提高磷的利用率,降低磷对环境污染,而且可解除植酸对饲料中营养因子螯合作用,提升饲料的营养价值,因而在国内外受到广泛关注。本研究对青藏高原地区土壤中产植酸酶微生物进行分离筛选,诱变选育,获得高产植酸酶菌株,并对其产植酸酶的性质进行了研究,取得了如下主要研究结果。1、从青藏高原土壤中共分离得到18株产植酸酶菌株,分别来自三种不同的生境,其中柴达木盆地灌丛沙丘根际分离得到10株(占55.5%),青藏高原沙化草原分离得到3株(占16.7%),青藏高原铁路沿线5株(27.8%),其它沙化地且植被较少的取样地未分离得到植酸降解菌。通过16s/18s rRNA基因序列分析方法对18株菌进行鉴定,其中Erwinia persicina AT1-1,Fusarium tricinctum BLH-2,Talaromyces pinophilus NMH 2-1-1,Cladosporium cladosporioides NMH 3-3-2菌株是首次发现植酸降解菌。对18株菌酶活的研究发现Penicillium glabrum NMH 2-3-1产植酸酶活性最高(2695.3 U/mL)。2、在28℃、160 r/min条件下对菌株Penicillium glabrum NMH 2-3-1进行摇瓶培养,培养6d后,对所产植酸酶进行了纯化和酶学性质研究,结果表明该酶在pH 4.0~8.0和20~60℃性质稳定,最适反应温度为55℃,60℃保温1h,酶活保持在75%,具有较好的热稳定性。Mn~(2+)、Cu~(2+)、Al~(3+)对该酶活具显著抑制作用,Ca~(2+)、Mg~(2+)显著提高该酶的活性。该酶具有较好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解能力。3、对Penicillium glabrum strain NMH 2-3-1进行了紫外线诱变选育,得到4株高产植酸酶的菌株,分别命名为P.glabrum U1、P.glabrum U2、P.glabrum U3、P.glabrum U4,其中P.glabrum U3产植酸酶酶活最高,达到3611.3 U/mL,较出发菌株提高34%。通过甲基磺酸乙酯(EMS)对P.glabrum U3株菌进行再次诱变,通过复筛,最终得到4株高产菌株,其中P.glabrum E1酶活比P.glabrum U3提高8.9%,达到4014.9 U/m L,较原始出发菌株提高了近49%。对P.glabrum E1连续传代培养,产酶性能基本稳定。4、通过Plackett-Burman实验设计对发酵条件进行优化。结果表明,培养液中NH4NO3、MnSO4、FeSO4的浓度是影响植酸酶酶活的显著因素。利用Box-Behnken设计进行了3因子优化设计,优化得到的培养基组成及发酵条件为:淀粉1.5%、NH_4NO_3 0.375%、Mg_SO_4·7H_2O 0.05%、KCl 0.05%、MnSO_4 0.008%、FeSO_4 0.0078%,pH 6.0,接种量2%,30℃,摇床转速160 r/min。酶活达4197.15 U/mL,较优化前菌株,植酸酶酶活提高了4.9%。5、在37℃条件下,用P.glabrum E1产植酸酶粗提液对麸皮、豆粕、棉粕、玉米粉四种饲料原料植酸磷降解率进行了测定,结果表明,4种原料的植酸磷含量分别为69.64%、62.82%、61.24%、44.00%,加入酶液3 h后,该植酸酶粗提液对4种饲料原料中植酸磷降解率分别为47.08%、59.95%、62.48%、65.74%,表明该植酸酶对四种原料中的麸皮植酸磷降解效率最好,然后依次是豆粕棉粕玉米粉,对麸皮的降解率要分别比豆粕、棉粕、玉米粉高出8.82%、4.96%、28.38%。
【关键词】：青藏高原 植酸酶 植酸降解菌 土壤微生物
【学位授予单位】：兰州交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S816
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 1 绪论11-22
• 1.1 植酸酶及其分类11-13
• 1.2 植酸酶来源13-14
• 1.2.1 植物源植酸酶13
• 1.2.2 动物源植酸酶13
• 1.2.3 微生物源植酸酶13-14
• 1.3 提高植酸酶产率的策略14-15
• 1.3.1 菌种的诱变14
• 1.3.2 基因工程菌14-15
• 1.3.3 原生质体融合技术15
• 1.4 植酸酶分离纯化技术15-17
• 1.4.1 预处理和浓缩15-17
• 1.4.2 层析纯化17
• 1.4.3 植酸酶的固定化17
• 1.5 植酸酶的国内外市场状况及其应用研究17-20
• 1.5.1 植酸酶的国内外市场状况17-18
• 1.5.2 饲料工业中的应用18-19
• 1.5.3 食品工业中的应用19
• 1.5.4 作为土壤改良剂19
• 1.5.5 促进植物生长中的应用19-20
• 1.5.6 其他应用领域20
• 1.6 前景与展望20
• 1.7 本文的研究目的及意义20-22
• 2 青藏高原土壤产植酸酶微生物的分离筛选及鉴定22-31
• 2.1 材料与方法22-25
• 2.1.1 土壤样品的采集22-23
• 2.1.2 培养基23
• 2.1.3 试剂的配制23
• 2.1.4 菌种的分离与筛选23-24
• 2.1.5 磷标准曲线的制备24
• 2.1.6 植酸酶酶活的测定24
• 2.1.7 产植酸酶微生物的DNA提取24
• 2.1.8 16S rRNA基因序列及 18S rRNA基因序列的PCR扩增与测序24-25
• 2.2 实验结果25-31
• 2.2.1 磷标准曲线的绘制25-26
• 2.2.2 产植酸酶菌株的筛选26-27
• 2.2.3 产植酸酶菌株的分子鉴定27-31
• 3 植酸酶的纯化及其酶学性质研究31-42
• 3.1 材料与方法31-33
• 3.1.1 试剂31
• 3.1.2 供试饲料原料31
• 3.1.3 实验仪器31-32
• 3.1.4 产植酸酶微生物的生长曲线及酶活的测定32
• 3.1.5 植酸酶的初步纯化32
• 3.1.6 植酸酶酶学性质研究32-33
• 3.1.7 无机磷含量的测定33
• 3.1.8 饲料原料中总磷含量的测定33
• 3.1.9 植酸磷降解率的测定33
• 3.2 实验结果33-42
• 3.2.1 菌株的生长及产酶曲线33-34
• 3.2.2 植酸酶粗提液的硫酸铵分级沉淀34-37
• 3.2.3 植酸酶的最适pH及稳定性37
• 3.2.4 植酸酶的最适温度及热稳定性37-38
• 3.2.5 金属离子对植酸酶酶活的影响38-39
• 3.2.6 胰蛋白酶和胃蛋白酶对植酸酶酶活的影响39
• 3.2.7 样品原料中磷含量分析39-40
• 3.2.8 原料中植酸磷降解效率分析40-42
• 4 菌株Penicillium glabrum的复合诱变42-48
• 4.1 材料与方法42-43
• 4.1.1 诱变菌株42
• 4.1.2 培养基42
• 4.1.3 主要试剂42
• 4.1.4 诱变方法42-43
• 4.2 实验结果43-48
• 4.2.1 P. glabrum的紫外诱变43
• 4.2.2 P. glabrum的EMS诱变43-44
• 4.2.3 P. glabrum E1的产酶稳定性44-45
• 4.2.4 P. glabrum E1的生长曲线及液态发酵特征45-48
• 5 菌株Penicillium glabrum E1产植酸酶发酵工艺优化48-58
• 5.1 材料与方法48-50
• 5.1.1 菌株48
• 5.1.2 培养基48
• 5.1.3 培养基实验方法48-50
• 5.2 实验结果50-58
• 5.2.1 单因素实验50-51
• 5.2.2 Plackett-Burman试验优化51-53
• 5.2.3 Box-Behnken试验优化53-55
• 5.2.4 响应面优化及分析55-58
• 6 讨论与结论58-63
• 致谢63-64
• 参考文献64-73
• 攻读学位期间的研究成果与参与项目73

【参考文献】

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本文编号：666331