诊断家畜日本血吸虫病胶体金免疫层析试纸条的研制

发布时间：2017-08-16 01:05

  本文关键词：诊断家畜日本血吸虫病胶体金免疫层析试纸条的研制

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【摘要】：血吸虫病是一种危害严重的人兽共患寄生虫病。家畜血吸虫病诊断技术主要为病原学诊断和免疫学诊断。但随着感染强度的不断下降,传统的诊断方法越来越不适用于现场应用。为适应基层血吸虫病筛查和普查的需要,有必要研制针对多种动物的快速检测试剂盒。胶体金免疫层析技术因其具有简便、快速、敏感、特异、无需特殊仪器等优点而适于疫区现场大规模筛查。本课题目的是研制一种敏感性高、特异性强能够检测多种动物日本血吸虫病的试纸条。根据链球菌蛋白G(SPG)具有与多种动物的IgG结合特性,对链球菌蛋白G进行生物学分析,设计重组蛋白G(rSPG)的基因序列,构建rSPG的2种原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达,得到带有GST和His标签的融合蛋白,通过亲和层析纯化蛋白。Western blotting的结果显示,两种rSPG均有与IgG结合的能力。ELISA测定2种带有不同标签的rSPG与牛、山羊、兔、鼠四个物种IgG的亲和力,显示带有GST标签的重组蛋白G的亲和力普遍高于商品化链球菌蛋白G,带有His标签的重组蛋白G的亲和力与商品化链球菌蛋白G相比基本一致。将两种重组蛋白G进行胶体金标记蛋白的最佳pH值、最佳标记量的确定,最后选用His-rSPG进行胶体金的标记及制备金标垫。分别用可溶性虫卵抗原(SEA)和His-rSPG作为检测线和质控线,确定其最佳划线浓度与血清最佳稀释度。结果表明,胶体金标记蛋白的最佳pH值为5.0、最佳标记量为10μg/ml;检测线和质控线的最佳划线浓度均为0.5 mg/mL;血清最佳稀释度为1:20。用组装好的试纸条检测标准阴、阳性BALB/c鼠与新西兰大白兔血清,以及粪检阴、阳性的山羊血清、水牛血清,评估其敏感性和特异性;用胶体金免疫层析试纸条法(GICA法)检测前后盘吸虫病牛血清、捻转血矛线虫病羊血清、东毕吸虫病羊血清,并与ELISA法相比较,评价其交叉反应性。为进一步对试纸条进行评价,分别用GICA法和ELISA法分别对不同感染强度的水牛血清进行检测。对于血纸的评价,用实验室人工感染的水牛阴、阳性血纸和从疫区采集的水牛血纸分别用GICA法和ELISA法进行检测,评估检测效果。结果表明,以重组蛋白G制备的试纸条可用于检测日本血吸虫感染BALB/c鼠、新西兰大白兔、水牛、山羊血清抗体。该试纸条检测日本血吸虫感染小鼠与兔血清的敏感性、特异型均为100.00%。检测山羊血清的敏感性为100.00%,与ELISA法相同;特异性为88.64%,高于ELISA法的75.00%。检测水牛血清的敏感性为100.00%,与ELISA法相同;特异性为94.23%,高于ELISA法的84.62%。其与前后盘吸虫交叉反应率为14.29%;与捻转血矛线虫交叉反应性为16.67%;与东毕吸虫的交叉反应性为33.33%。在对不同感染强度的水牛血清进行评估时,GICA法和ELISA法检测日本血吸虫感染的水牛血清其特异性均为100.00%。在感染强度20条/头时,GICA法的敏感性为75.00%低于ELISA法的100.00%。在感染强度20条/头时,GICA法和ELISA法的敏感性均为100.00%。对水牛血纸进评估时,对于实验室人工感染水牛血纸GICA法和ELISA法的敏感性和特异性均为100.00%,并且两种方法之间无统计学差异。综上,本研究成功表达了重组链球菌蛋白G,并研制出能检测多种家畜血吸虫病的胶体金免疫层析试纸条,其检测家畜血吸虫感染的敏感性和特异性均较高。
【关键词】：日本血吸虫 链球菌蛋白G 免疫诊断 胶体金免疫层析试纸条
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S855.9
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文缩略表12-13
• 第一章 引言13-22
• 1.1 血吸虫病概述13-14
• 1.2 日本血吸虫病诊断方法14-18
• 1.2.1 病原学诊断14
• 1.2.2 免疫学诊断14-16
• 1.2.3 分子生物学诊断16-18
• 1.3 胶体金免疫层析试验18-22
• 1.3.1 胶体金的发现18
• 1.3.2 胶体金的性质及制备18-19
• 1.3.3 胶体金探针的制备19
• 1.3.4 胶体金免疫检测技术19-20
• 1.3.5 胶体金免疫层析技术的应用20-22
• 第二章 链球菌蛋白G的结构域重构、表达及鉴定22-37
• 2.1 引言22
• 2.2 实验材料22-26
• 2.2.1 生物材料22
• 2.2.2 仪器设备22-23
• 2.2.3 酶和试剂23
• 2.2.4 试剂配制23-26
• 2.3 实验方法26-29
• 2.3.1 重组蛋白G的构建26
• 2.3.2 重组质粒的构建、转化和表达26-28
• 2.3.3 重组蛋白的纯化28
• 2.3.4 Western blotting检测重组蛋白与IgG的结合活性28-29
• 2.3.5 ELISA法测定重组蛋白与不同物种IgG亲和常数29
• 2.4 结果29-35
• 2.4.1 重组蛋白G原核表达质粒构建29-30
• 2.4.2 重组蛋白的诱导表达和可溶性鉴定30-32
• 2.4.3 重组蛋白的纯化32
• 2.4.4 重组蛋白与IgG结合活力测定32-33
• 2.4.5 ELISA法测定重组蛋白与不同物种IgG亲和常数33-35
• 2.5 讨论35-37
• 第三章 胶体金免疫层析试纸条的组装及优化37-48
• 3.1 引言37
• 3.2 实验材料37-38
• 3.2.1 生物材料37
• 3.2.2 仪器设备37
• 3.2.3 酶和试剂37-38
• 3.2.4 试剂配制38
• 3.3 实验方法38-41
• 3.3.1 胶体金的烧制38
• 3.3.2 可溶性虫卵抗原（SEA）的制备38-39
• 3.3.3 胶体金标记的最佳PH值39
• 3.3.4 胶体金标记的最佳蛋白标记量39
• 3.3.5 胶体金探针的制备39-40
• 3.3.6 胶体金免疫层析试纸条的制备及优化40-41
• 3.3.7 胶体金免疫层析试纸条保存41
• 3.4 结果41-46
• 3.4.1 胶体金颗粒的鉴定41-42
• 3.4.2 胶体金标记蛋白的最佳PH值及最佳蛋白标记量42-44
• 3.4.3 稳定液及重悬液的选择44
• 3.4.4 金标垫及样品垫的选择44-45
• 3.4.5 检测线、质控线及血清最佳用量45-46
• 3.5 讨论46-48
• 第四章 胶体金免疫层析试纸条的初步应用48-56
• 4.1 引言48
• 4.2 实验材料48-49
• 4.2.1 生物材料48
• 4.2.2 仪器设备48
• 4.2.3 酶和试剂48
• 4.2.4 试剂配制48-49
• 4.3 实验方法49-51
• 4.3.1 GICA法对实验动物血吸虫病的检测49
• 4.3.2 GICA法对水牛、山羊血吸虫病的检测49
• 4.3.3 GICA法对水牛不同感染强度的血吸虫病检测49
• 4.3.4 试纸条交叉反应性的初步评价49-50
• 4.3.5 GICA法对水牛血纸的检测50
• 4.3.6 统计学分析50
• 4.3.7 胶体金免疫层析试纸条的稳定性实验50-51
• 4.3.8 胶体金免疫层析试纸条的重复性实验51
• 4.4 实验结果51-55
• 4.4.1 GICA法检测的敏感性、特异性51-52
• 4.4.2 对水牛不同感染强度的检测52-53
• 4.4.3 交叉反应性53
• 4.4.4 对水牛血纸检测53-54
• 4.4.5 稳定性实验54-55
• 4.4.6 重复性实验55
• 4.5 讨论55-56
• 第五章 全文结论56-57
• 参考文献57-63
• 致谢63-64
• 作者简历64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 陈小锋,刘曙照;胶体金标记免疫分析及其在小分子化合物快速检测中的应用[J];药物生物技术;2004年04期

2 丁建祖,干小仙,沈慧英,沈丽英,俞涧;快速检测抗日本血吸虫抗体的金标免疫渗滤法的建立及应用[J];中国寄生虫病防治杂志;1998年04期

3 曹之舫;武建国;;链球菌蛋白G——一种优于葡萄球菌蛋白A的IgG结合物[J];国外医学(微生物学分册);1989年05期

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本文编号：680705