1型鸭甲肝病毒2A蛋白功能初探

发布时间：2017-08-16 02:16

  本文关键词：1型鸭甲肝病毒2A蛋白功能初探

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【摘要】：鸭甲型肝炎病毒(DHAV)属于小RNA病毒科的禽肝病毒属,对雏鸭具有高致病性和高致死率,具有传播迅速的特点。为了探究其2A蛋白的功能,我们开展了2A蛋白生物信息学特性、2A2和2A3蛋白的原核表达纯化、制备抗2A1/2A2/2A3蛋白的多克隆抗体、2A1蛋白自我切割功能、2A2和2A3蛋白的完整性和独立性、2A2蛋白诱导细胞凋亡、2A2蛋白的GTPase活性等项研究。获如下结果：1、2A蛋白的生物信息学特性分析通过NetPicoRna V1.0在线服务器预测2A蛋白的切割位点：2A1和2A2之间的切割位点是NPG/P,2A2和2A3之间的切割位点是S/H;运用ClustalW软件对DHAV-1的2A蛋白与其他小RNA病毒的2A蛋白进行多重蛋白质序列比对,经GeneDoc软件进行整理编辑,结果表明DHAV-1的2A蛋白是由NPGP样的2A1、GTPase样的2A2和H-NC样的2A3组成。将2A2氨基酸序列输入MEGA6.0,通过neighbour-joining (NJ)方法构建进化树以及用SWISS-MODEL服务器对2A2蛋白的三级结构进行同源建模,预测分析表明2A2蛋白与GTPase家族具有相同的进化来源和结构上的相似性。2、2A2蛋白和2A3蛋白的原核表达、纯化及免疫印迹试验根据2A2和2A3的基因序列设计两对引物P1P2和P3P4,从含DHAV-1的鸭胚尿囊液中提取RNA,反转录成cDNA并作为模板,PCR扩增分别获得2A2基因和2A3基因片段,克隆至pMD19-T载体,鉴定正确后,再分别亚克隆至pET-32(a)+原核表达载体。获得2A2蛋白和2A3蛋白的最佳表达条件均为用0.4 mmol/L IPTG于37℃诱导4 h；2A2蛋白可经洗涤包涵体的方式纯化,2A3蛋白通过Ni2+-NTA琼脂糖凝胶亲和层析进行纯化。表达的两种蛋白经免疫印迹证实能够被鸭抗DHAV-1抗体识别。3、鼠或兔抗2A1、2A2和2A3蛋白多克隆抗体的制备人工合成的2A1蛋白多肽免疫小鼠制备鼠抗2A1蛋白的多克隆抗体,通过ELISA测得其抗体效价为1：6400；经包涵体洗涤纯化的2A2蛋白分别免疫小鼠和兔子制备鼠抗和兔抗2A2蛋白的多克隆抗体,结果鼠抗和兔抗的琼扩效价均为1：16;通过Ni2+-NTA琼脂糖凝胶亲和层析纯化的2A3蛋白免疫兔子制备兔抗2A3蛋白的多克隆抗体,其琼扩效价最高为1：32。4、2A1蛋白的自我切割试验根据红色荧光蛋白(RFP)的基因序列设计一对引物P1P2,以pDsRED载体为模板,扩增RFP片段；将2A1基因的反向互补序列插入到P2的5’端,即得到了扩增RED-2A1片段的下游引物P3,利用引物P1P3,以pDsRED载体为模板,扩增RED-2A1片段；将RFP片段和RED-2A1片段分别插入pEGFP-N1,获得含有双荧光报告基因的重组质粒pRED-EGFP和pRED-2A1-EGFP;将构建的重组质粒分别转染鸭胚成纤维细胞(DEF),在荧光显微镜下可以看到同一视野中的细胞发出红色和绿色两种荧光,说明重组质粒构建成功；分别提取转染了pRED-EGFP、pRED-2A1-EGFP、pDsRED和pEGFP-N1四种质粒后的细胞的总蛋白,经SDS-PAGE后,分别用抗2A1蛋白抗体、抗红色和绿色荧光蛋白的抗体做免疫印迹,结果表明2A1蛋白具有自我切割的功能。5、2A2和2A3蛋白完整性、独立性试验DHAV-1接种DEF后72 h时,收集并裂解细胞,将获得的细胞裂解液上清分为两份并分别与兔抗2A2和2A3蛋白抗体进行免疫沉淀(IP)试验,结果两种不同的抗体沉淀出了两种分子量不同的蛋白；用鸭抗DHAV-1抗体经免疫印迹分析表明这两种蛋白分别为2A2和2A3蛋白。感染DHAV-1后的DEF进行间接免疫荧光(IFA)试验,同一细胞同时用两种不同的一抗(兔抗2A3蛋白抗体和鼠抗2A2蛋白抗体)进行孵育,再用FITC标记的羊抗兔IgG和TRITC标记的羊抗鼠IgG的二抗同时进行孵育,试验结果表明2A2蛋白主要定位在细胞核中,少量定位在细胞质中,而2A3蛋白主要定位在细胞质中,少量定位在细胞核中。IP及IFA结果表明DHAV-1的2A2蛋白与2A3蛋白是两个相互独立的蛋白。6、2A2蛋白诱导鸭胚成纤维细胞凋亡试验将已构建好的pMD19-T/2A2质粒与pcDNA3.1(+)空载分别用BamHⅠ租Xho Ⅰ双酶切后进行连接,成功获得真核表达质粒pcDNA3.1(+)/2A2,并将其转染DEF,36 h时收获细胞,通过IFA及免疫印迹分析表明2A2蛋白在DEF中表达。转染重组质粒48 h时收获细胞,提取细胞的DNA,经2%的琼脂糖凝胶电泳可以看到明显的DNA Ladder;通过HE染色和DAPI细胞核染色可以看到细胞核出现边移、碎裂的凋亡现象；TUNEL法观察到凋亡细胞的细胞核染成深棕色；经过Annexin V-FITC/PI双染后,流式细胞仪检测发现转染了重组质粒pcDNA3.1(+)/2A2的实验组凋亡细胞的比率明显高于转染空质粒pcDNA3.1(+)的对照组。结果表明DHAV-1的2A2蛋白能够诱导DEF凋亡。7、2A2蛋白的GTP酶活性试验诱导原核表达质粒pET-32(a)+/2A2表达,将表达于上清中的2A2蛋白通过Ni2+-NTA琼脂糖凝胶亲和层析进行纯化,利用GTP酶试剂盒验证其是否具有GTPase活性。结果表明DHAV-1的2A2蛋白在室温下30 min就能够水解GTP产生游离的磷酸根,其与试剂盒中的孔雀绿试剂反应形成深绿色的产物,在620 nm处测定其吸光值(0.627),与空载组的吸光值(0.124)及不加GTP底物的对照组的吸光值(0.035)有极显著性差异P0.01。结果表明DHAV-1的2A2蛋白具有GTPase的活性。
【关键词】：鸭甲型肝炎病毒 2A蛋白 功能
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-8
• 缩略词及符号说明表8-12
• 1 引言12-17
• 1.1 小RNA病毒的蛋白结构特点12-13
• 1.2 小RNA病毒2A在细胞中的定位13-14
• 1.3 小RNA病毒2A蛋白的功能研究概况14-16
• 1.3.1 初级切割病毒编码的多聚蛋白14
• 1.3.2 2A诱导细胞凋亡14-15
• 1.3.3 促进病毒RNA的复制15
• 1.3.4 抑制宿主细胞蛋白合成15-16
• 1.4 小G蛋白家族的研究概况16
• 1.5 选题的目的和意义16-17
• 2 试验研究17-26
• 2.1 试验材料17-18
• 2.1.1 毒株、菌种及试验动物17
• 2.1.2 主要试剂及耗材17
• 2.1.3 血清17-18
• 2.1.4 主要仪器设备18
• 2.2 方法18-26
• 2.2.1 2A蛋白生物信息学分析18
• 2.2.2 DHAV-1的2A2、2A3蛋白原核表达及多克隆抗体制备18-21
• 2.2.3 2A2和2A3蛋白完整性、独立性试验21-22
• 2.2.4 2A1的自我剪切试验22-23
• 2.2.5 2A2诱导鸭胚成纤维细胞凋亡23-25
• 2.2.6 2A2蛋白GTP酶活性试验25-26
• 3 结果26-52
• 3.1 2A基因的生物信息学分析26-30
• 3.1.1 DHAV-1多重蛋白质序列比对26-27
• 3.1.2 DHAV-12A蛋白多重蛋白质序列比对27-29
• 3.1.3 DHAV-1的2A2蛋白进化树构建29
• 3.1.4 DHAV-1的2A2蛋白同源建模29-30
• 3.2 2A2和2A3蛋白的克隆和原核表达及纯化30-37
• 3.2.1 2A2和2A3基因PCR扩增30
• 3.2.2 2A2和2A3基因的T克隆及亚克隆30-32
• 3.2.3 2A2和2A3蛋白的表达及纯化32-36
• 3.2.4 2A1、2A2和2A3蛋白的多抗制备36-37
• 3.3 2A2和2A3蛋白是两种不同的蛋白37-39
• 3.3.1 免疫沉淀试验37-39
• 3.3.2 间接免疫荧光试验39
• 3.4 2A1自我切割试验39-42
• 3.4.1 RFP和RFP-2A1基因的PCR扩增39-40
• 3.4.2 重组质粒pRFP-EGFP和pRFP-2A1-EGFP的酶切鉴定40
• 3.4.3 重组质粒转染细胞后荧光的观察40-41
• 3.4.4 免疫印迹分析41-42
• 3.5 2A2蛋白诱导细胞凋亡试验42-49
• 3.5.1 构建重组质粒pcDNA3.1-2A242-43
• 3.5.2 免疫荧光检测2A2蛋白的真核表达试验43-44
• 3.5.3 真核表达的2A2蛋白的免疫印迹试验44
• 3.5.4 细胞形态的观察44-45
• 3.5.5 DNA Ladder法检测细胞凋亡45-46
• 3.5.6 细胞核形态变化46-47
• 3.5.7 TUNEL法检测细胞凋亡47-48
• 3.5.8 流式细胞仪检测细胞凋亡48-49
• 3.6 2A2蛋白GTP酶活性测定49-52
• 3.6.1 2A2蛋白纯化49-50
• 3.6.2 磷酸盐标准品的制备50-51
• 3.6.3 酶样品的测定51
• 3.6.4 GTP酶活力计算51-52
• 4 讨论52-56
• 4.1 2A蛋白的生物信息学特性分析52
• 4.2 2A2和2A3蛋白的原核表达与纯化及免疫印迹试验52-53
• 4.3 鼠或兔抗2A1、2A2和2A3蛋白多克隆抗体的制备53
• 4.4 2A2和2A3蛋白完整性、独立性试验53-54
• 4.5 2A2蛋白诱导DEF凋亡试验54-55
• 4.6 2A1蛋白的自我切割试验55
• 4.7 2A2蛋白的GTP酶活性试验55-56
• 5 结论56-57
• 参考文献57-64
• 致谢64-65
• 攻读硕士学位期间从第一作者身份发表的文章65

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本文编号：680991