猪博卡病毒多重PCR检测和分型研究

发布时间：2017-08-23 17:19

  本文关键词：猪博卡病毒多重PCR检测和分型研究

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【摘要】：猪博卡病毒(Porcine bocavirus,PBoV)是无囊膜单链线状DNA博卡病毒属成员。自2009年在瑞典患断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)猪体内被检测出后,在世界范围内广泛流行,多个病毒种或基因型被发现,依据系统进化关系可分为G1,G2,G3三个PBoV基因群组。这一新发猪病毒引起了各国的普遍关注,但人们对其研究仍处于初级的探索阶段,PBoV的检测和分型方法并不全面。因此发展有效和可靠的检测技术对PBoV流行病学调查分析非常重要。在本研究中,分别构建了PBoV普通多重PCR和EvaGreen多重实时荧光PCR检测方法并应用于临床样品检测。本研究中,在对三个基因群组基因组序列进行同源性分析的基础上,分别设计特异性引物,首先构建了一个普通多重PCR方法用于同时检测和鉴定不同分型的PBoV。此方法可特异地检测三个PBoV基因群组,对PBoV G1,PBoV G2和PBoV G3检测灵敏度分别为1.0×103,4.5×103和3.8×103 copies/μL,与三个PBoV基因群组普通单重PCR的灵敏度1.0×103 copies/μL相近。利用新建立的多重PCR检测方法来检测227个临床样品。PBoV G1,PBoV G2和PBoV G3检测阳性率分别为1.3%,2.6%和12.3%。其中三个基因群组检测有混合感染,PBoV G1与PBoV G3、PBoV G2与PBoV G3及PBoV G1、PBoV G2与PBoV G3混合感染检出率分别为0.4%、0.9%和0.4%。除在猪粪样品中多检测出一个PBoV G2阳性外,PBoV基因群组单重PCR结果与多重PCR结果相同。建立的基于EvaGreen PBoV单重或多重实时荧光PCR扩增后经熔解曲线分析,三个基因群组的扩增产物均形成特异熔解峰,PBoV G1、PBoV G2和PBoV G3的Tm值分别为81.3±0.34°C,78.2±0.37°C和85.0±0.29°C,各病毒间Tm值间隔在3°C左右,而非靶标病毒及空白阴性对照无特异熔解峰产生,通过Tm差异可区分鉴定三个PBoV基因群组,表明建立的方法具有良好的特异性。三个基因群组EvaGreen单重实时荧光PCR检测灵敏度分别为25 copies/μL(PBoV G1),10 copies/μL(PBoV G2)和25 copies/μL(PBoV G3);而EvaGreen多重实时荧光PCR体系下单个基因群组的检测灵敏度稍有下降,依次为100 copies/μL(PBoV G1)、50 copies/μL(PBoV G2)和100 copies/μL(PBoV G3);三个基因群组同时存在时EvaGreen多重实时荧光PCR检测灵敏度依次为250 copies/μL(PBoV G1),250 copies/μL(PBoV G2)和100 copies/μL(PBoV G3)。EvaGreen单重实时荧光PCR和EvaGreen多重实时荧光PCR的重复性试验变异系数都小于5%,具有较好的重复性。EvaGreen多重实时荧光PCR对227个样品检测结果为:PBoV G1阳性率为15.0%,PBoV G2的阳性率为25.1%,PBoV G3的阳性率为41.9%,与利用EvaGreen单重实时荧光PCR检测的17.2%PBoV G1,29.1%PBoV G2和44.5%PBoV G3阳性率结果较为一致;其中,PBoV G1与PBoV G2、PBoV G1与PBoV、G3 PBoV G2与PBoV G3及PBoV G1、PBoV G2与PBoV G3混合感染检出率分别为3.1%、5.7%、13.2%及3.1%。上述结果表明PBoV在国内猪群中较流行。对PBoV检测阳性的样品进行克隆测序,并将测得的目的片段序列分别与PBoV全基因组序列或者接近全基因组序列间的核苷酸序列进行基因序列比对、同源性和系统进化树分析。结果显示三组PBoV基因群组内的同源性比较高,范围在72.1-100%之间,而基因群组间的核苷酸序列同源性较低为3.2-54.2%,表明将本研究构建的普通多重PCR和EvaGreen多重实时荧光PCR两组PBoV检测方法选择的诊断区区分PBoV G1、PBoV G2与PBoV G3三个基因群组的基因分型方法可行且具有代表性,同时证实猪群中PBoV具有较高的遗传多样性。本研究成功构建立了普通多重PCR和Eva Green多重实时荧光PCR两组PBoV检测和分型方法,可以满足不同调查和研究的检测需求,这两组多重PCR检测方法能最大限度地节约检测时间,提高工作效率,适合养猪场大批量检测需求,为PBoV的流行病学调查研究和临床检测提供了良好的检测技术手段。
【关键词】：猪博卡病毒 基因群组 多重PCR EvaGreen多重实时荧光PCR 检测
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-13
• 第一章 绪论13-21
• 1.1 PBoV的发现13
• 1.2 PBoV的分类13-15
• 1.3 PBoV的分子生物学特性15-16
• 1.4 PBoV的流行病学调查和疾病相关性16-18
• 1.4.1 国内PBoV的流行情况16-17
• 1.4.2 国外PBoV的流行情况17-18
• 1.5 PBoV的检测技术18-21
• 1.5.1 环介导等温扩增技术18
• 1.5.2 间接免疫荧光法18-19
• 1.5.3 聚合酶链式反应19
• 1.5.4 实时荧光定量聚合酶链式反应19-21
• 第二章 PBoV多重PCR检测和基因分型研究的实验方案设计21-24
• 2.1 本研究的目的、意义21
• 2.2 实验主要内容21-23
• 2.2.1 引物设计21-22
• 2.2.2 标准品构建及普通多重PCR构建22
• 2.2.3 三个PBoV基因群组单重实时荧光PCR体系的优化和建立22
• 2.2.4 多重实时荧光PCR体系同时检测三个PBoV基因群组的优化和建立22-23
• 2.3 实验流程23-24
• 第三章 PBoV多重PCR检测方法的建立和应用24-36
• 3.1 实验材料24-25
• 3.1.1 病毒和临床样品24-25
• 3.1.2 主要试剂25
• 3.1.3 主要仪器设备25
• 3.2 引物设计25-26
• 3.3 病毒核酸提取和质粒标准品制备26-27
• 3.3.1 PBoV DNA提取26
• 3.3.2 PCR反应26
• 3.3.3 PCR产物割胶回收26
• 3.3.4 PCR目的片段连接26
• 3.3.5 连接产物转化26
• 3.3.6 重组质粒提取26-27
• 3.3.7 重组质粒鉴定27
• 3.3.8 重组质粒标准品制备27
• 3.4 PBoV多重PCR体系建立27-28
• 3.4.1 PBoV多重PCR体系优化27
• 3.4.2 PBoV多重PCR灵敏度和特异性27-28
• 3.5 PBoV临床样品多重PCR检测28
• 3.5.1 样品核酸提取28
• 3.5.2 临床样品检测28
• 3.6 结果28-33
• 3.6.1 PBoV序列系统发育树分析图28-30
• 3.6.2 标准品构建30
• 3.6.3 PBoV多重PCR体系优化30-31
• 3.6.4 PBoV G1, PboV G2和G3 Pbo V多重PCR特异性和灵敏度31-33
• 3.6.5 临床样品单重和多重普通PCR检测33
• 3.7 讨论33-36
• 第四章 EvaGreen多重实时荧光PCR检测PBoV三个基因群组方法的建立和应用36-56
• 4.1 实验材料36-37
• 4.1.1 毒源36-37
• 4.1.2 主要试剂37
• 4.1.3 主要仪器设备37
• 4.2 引物设计37-38
• 4.3 PBoV EvaGreen单重实时荧光PCR38-39
• 4.3.1 PBoV单重荧光PCR特异性及产物Tm值38
• 4.3.2 PBoV单重荧光PCR灵敏度及重复性38-39
• 4.4 PBoVEvaGreen多重实时荧光PCR39-40
• 4.4.1 PBoV多重荧光PCR特异性及产物Tm值39
• 4.4.2 PBoV多重荧光PCR灵敏度及重复性39-40
• 4.5 PBoVEvaGreen多重实时荧光PCR方法检测临床样品40
• 4.5.1 临床样品及样品核酸提取40
• 4.5.2 临床样品检测40
• 4.6 结果40-52
• 4.6.1 PBoV单重实时荧光PCR的扩增产物Tm值40-41
• 4.6.2 PBoV单重实时荧光PCR特异性41-42
• 4.6.3 PBoV单重实时荧光PCR灵敏度及标准曲线42-43
• 4.6.4 PBoV单重实时荧光PCR重复性43-45
• 4.6.5 PBoV多重实时荧光PCR的扩增产物Tm值45
• 4.6.6 PBoV多重实时荧光PCR特异性45-46
• 4.6.7 单个PBoV模板多重实时荧光PCR灵敏度及标准曲线46-48
• 4.6.8 多个PBoV模板多重实时荧光PCR灵敏度48-49
• 4.6.9 PBoV多重实时荧光PCR重复性49-50
• 4.6.10 PBoV临床样品实时荧光PCR检测50-52
• 4.7 讨论52-56
• 第五章 PBoV遗传多样性分析56-63
• 5.1 材料和方法56
• 5.2 结果56-61
• 5.3 讨论61-63
• 结论与展望63-64
• 参考文献64-68
• 研究生学习期间主要成果68-69
• 致谢69

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