CaMKⅡ在镉致原代大鼠成骨细胞内质网凋亡途径中的作用

发布时间：2017-08-24 12:30

  本文关键词：CaMKⅡ在镉致原代大鼠成骨细胞内质网凋亡途径中的作用

  更多相关文章： 镉 成骨细胞 细胞凋亡 内质网应激

【摘要】：镉作为广泛存在的重金属污染物,通常以镉离子的形式通过钙离子泵、离子通道型受体等进入细胞,进而影响胞内钙离子分布。胞内钙离子浓度改变引起CaMK Ⅱ表达水平的变化以及内质网应激反应。而CaMK Ⅱ在成骨细胞凋亡和内质网应激中的作用鲜有报道。为了研究镉致钙稳态失衡引起内质网应激产生的影响,原代成骨细胞暴露于镉及内质网钙离子通道抑制剂2-APB,流式细胞术测定细胞内钙离子浓度,RTCA检测细胞存活率,蛋白免疫印迹法检测UPR相关蛋白的表达。结果表明2 μmol/L醋酸镉、50μmol/L 2-APB及其共处理成骨细胞后,与对照组相比,镉处理导致细胞存活率显著降低,且伴随着细胞内钙离子浓度升高(P0.01); 2-APB与镉共处理组和镉处理组相比,细胞内钙离子浓度显著降低(P＜0.01)；不同浓度的醋酸镉(0、0.25、0.5、1、2、5、10μmol/L)处理6h或2μmol/L醋酸镉处理成骨细胞不同时间(0、0.5、1、5、10、30 min或2、4、6 h)后,与对照组相比,2μmol/L醋酸镉处理成骨细胞6小时能显著提高BiP、ATF4、CHOP三个蛋白的表达水平(P)＜0.05或P＜0.01)。为了研究镉对成骨细胞CaMKⅡ表达的影响及CaMKⅡ在镉致内质网应激中的作用,原代成骨细胞暴露于镉、2-APB或CaMKⅡ抑制剂KN93, RTCA检测细胞存活率,蛋白免疫印迹法检测CaMKⅡ、P-CaMKⅡ和UPR相关蛋白的表达。结果表明与对照组相比,2μmol/L醋酸镉处理成骨细胞6小时能显著提高CaMKⅡ的磷酸化水平；与镉处理组相比,2-APB与镉共处理组显著降低CaMKⅡ的磷酸化水平;而KN93与镉共处理组显著提高细胞存活率,且显著降低了ATF4和CHOP蛋白的表达(P＜0.05或P＜0.01)。为了研究镉致成骨细胞凋亡的过程中内质网应激和CaMKⅡ的作用,成骨细胞暴露于镉、2-APB或KN93,流式细胞术检测细胞凋亡率,双苯酰亚胺(Hoechst 33258)染色观察细胞核形态,蛋白免疫印迹法检测Caspase-12、3, Bax和Bcl-2蛋白的表达。结果表明2 μmol/L镉暴露成骨细胞6h后,细胞凋亡率、Caspase-12、3蛋白活化水平和Bax/Bcl-2水平极显著高于对照组(P0.01); 2-APB与镉共处理组以及KN93与镉共处理组细胞凋亡率、Caspase-12、3蛋白活化水平和Bax/Bcl-2水平极显著低于镉处理组(P0.01); Hoechst 33258染色结果与上述一致。综上所述,镉通过引发内质网释放钙离子造成胞浆钙超载,诱导内质网应激反应,最后通过Caspase-12、3以及BCL-2家族蛋白途径导致原代大鼠成骨细胞凋亡；CaMKⅡ参与这个过程并发挥重要作用。
【关键词】：镉 成骨细胞 细胞凋亡 内质网应激
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.3
【目录】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-6
• 缩略表6-11
• 第一部分 文献综述11-26
• 第一章 镉致骨骼毒性的研究进展11-16
• 1. 镉致骨骼毒性的流行病学研究11-12
• 2. 镉致骨毒性的机制12-16
• 2.1 镉间接致骨毒性12-13
• 2.2 镉直接致骨毒性13-14
• 2.3 镉致骨毒性与其他微量元素的关系14-16
• 第二章 细胞凋亡中镉和钙的相互作用16-21
• 1. 镉与钙及其相关蛋白16-19
• 1.1 镉与钙稳态16-17
• 1.2 镉对钙调蛋白的作用17-18
• 1.3 镉对CaMKⅡ的作用18-19
• 2. 镉与细胞凋亡19-21
• 2.1 镉对细胞凋亡的影响19
• 2.2 镉对钙蛋白酶的影响19
• 2.3 钙调蛋白在细胞凋亡中的作用19-21
• 第三章 内质网应激在细胞凋亡过程中的作用21-25
• 1. 内质网应激与细胞凋亡21-22
• 2. 镉诱导内质网应激22-23
• 3. 内质网应激和UPR调节镉诱导的细胞凋亡23-25
• 本研究的目的与意义25-26
• 第二部分 试验研究26-63
• 第一章 镉致成骨细胞钙超载及内质网钙稳态失衡引发内质网应激26-34
• 1. 材料26-27
• 1.1 实验动物26
• 1.2 主要仪器26-27
• 1.3 主要试剂及材料27
• 2. 方法27-29
• 2.1 溶液配制27
• 2.2 SD大鼠成骨细胞的准备27-28
• 2.2.1 成骨细胞的分离培养27-28
• 2.2.2 成骨细胞的消化传代28
• 2.3 细胞存活率监测28
• 2.4 流式细胞术检测细胞内游离钙离子浓度28
• 2.5 免疫印迹检测成骨细胞中BiP、ATF4、CHOP蛋白表达28-29
• 2.5.1 细胞处理28-29
• 2.5.2 蛋白样品制备29
• 2.5.3 免疫印迹29
• 2.6 数据分析29
• 3. 结果29-33
• 3.1 镉对细胞存活率、细胞内钙离子浓度的影响及2-APB的保护效应29-31
• 3.2 镉对原代大鼠成骨细胞UPR蛋白表达的影响31-33
• 3.2.1 镉暴露不同时间段对细胞UPR蛋白表达的影响31
• 3.2.2 不同浓度镉对原代大鼠成骨细胞UPR蛋白表达的影响31-33
• 4. 讨论33-34
• 第二章 镉致成骨细胞CaMKⅡ表达水平变化及其在内质网应激中的作用34-40
• 1. 材料34
• 1.1 实验动物34
• 1.2 主要仪器34
• 1.3 主要试剂及材料34
• 2. 方法34-35
• 2.1 细胞培养34
• 2.2 免疫印迹检测成骨细胞中CaMKⅡ、BiP、ATF4、CHOP蛋白表达34
• 2.3 数据分析34-35
• 3. 结果35-38
• 3.1 镉对原代大鼠成骨细胞CaMKⅡ蛋白表达的影响35-36
• 3.2 镉及2-APB对原代大鼠成骨细胞CaMKⅡ蛋白表达水平的影响36
• 3.3 镉及KN93对原代大鼠成骨细胞细胞活性及UPR蛋白表达水平的影响36-38
• 4. 讨论38-40
• 第三章 CaMKⅡ在镉致成骨细胞内质网应激引发细胞调亡过程中的作用40-49
• 1. 材料40
• 1.1 实验动物40
• 1.2 主要仪器40
• 1.3 主要试剂及材料40
• 2. 方法40-41
• 2.1 细胞核荧光染色40-41
• 2.2 Annexin V-FITC流式细胞检测41
• 2.3 Western Blot分析凋亡蛋白表达41
• 2.4 数据分析41
• 3. 结果41-47
• 3.1 镉及2-APB对原代大鼠成骨细胞Caspase蛋白表达的影响41-42
• 3.2 镉及KN93对原代大鼠成骨细胞Caspase蛋白表达的影响42-43
• 3.3 镉及2-APB或KN93对成骨细胞凋亡水平的影响43-47
• 3.3.1 镉及2-APB或KN93对成骨细胞凋亡率的影响43-44
• 3.3.2 镉及2-APB或KN93对成骨细胞核形态的影响44-45
• 3.3.3 镉及2-APB或KN93对成骨细胞BCL2家族蛋白表达的影响45-47
• 4. 讨论47-49
• 全文结论49-50
• 参考文献50-63
• 致谢63-64
• 攻读学位期间论文发表情况64-65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 孔凡虹;董成亚;何露;王雅杰;;实时无标记细胞检测技术在细胞培养质量控制中的应用[J];标记免疫分析与临床;2016年02期

2 陈晨;张刚;谷铭勇;李宗玉;桑成林;左贵来;;骨细胞网络结构对骨形成和骨吸收的影响[J];中国骨质疏松杂志;2016年01期

3 李娜;尚蕾;熊鲲;黄菊芳;;钙蛋白酶调控细胞死亡的研究进展[J];解剖学杂志;2015年04期

4 章振林;;骨代谢相关信号通路与抗骨质疏松新型药物的研发[J];药品评价;2015年15期

5 贾荣飞;朱国英;金泰^，

本文编号：731320