猪生长激素与促生长肽的肝细胞内化比较及亚细胞定位研究

发布时间：2017-08-24 12:31

  本文关键词：猪生长激素与促生长肽的肝细胞内化比较及亚细胞定位研究

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【摘要】：猪生长激素(Porcine growth hormone,pGH)是由191个氨基酸组成的肽类激素,对猪生长发育具有重要的调节作用。肝脏是pGH发挥作用的最重要靶器官之一,pGH的诸多生物学功能均通过肝细胞实现。传统理论认为pGH通过与细胞膜上生长激素受体(Growth hormone receptor,GHR)结合后,引起pGH的一系列构象变化,从而发挥其生理作用。但是近年关于人生长激素(Human growth hormone,hGH)在鼠肝细胞中作用机理的研究表明,生长激素(Growth hormone,GH)需要与GHR结合后才能内化进入细胞,进而发挥其生物学功能,其内化后主要作用的部位可由亚细胞定位研究来明确。目前尚无GH在同种动物细胞上的作用机制及亚细胞定位研究报道。本试验选用由新生仔猪肝脏所分离的肝细胞为研究对象,分别给予pGH及本研究室制备的具有模拟pGH作用的促生长肽处理,进行pGH与促生长肽在不同时间点内化进入细胞量的差异比较及pGH在亚细胞中的定位观察,研究GH和促生长肽在亚细胞水平上的作用的部位和结合方式上是否存在的差异。旨在研究pGH在猪肝细胞内化现象以及内化进入细胞后的主要作用部位,为揭示GH在同种动物细胞上的作用机制提供更加确切的试验依据。经试验设计,开展了如下研究:首先,通过流式细胞术和Western-blot试验,对肝细胞的凋亡情况和细胞表面GHR的表达情况进行鉴定,以验证试验所分离的肝细胞的活性。结果显示:采用的猪原代细胞分离法所分离的猪肝细胞的细胞成活率达到80.94%;对原代分离的肝细胞在不同时间点的观测证明,细胞膜上GHR蛋白表达无显著差异,表明了新分离的细胞,能够满足试验可用性与一致性的要求。其次,采用共聚焦显微镜观察p GH与促生长肽内化进入猪肝细胞过程中的差异。对内化过程不同时间点的观察中发现:细胞质内与细胞核内pGH均呈正态分布曲线趋势,即随着内化的开始,pGH进入细胞的量逐渐增多,达到峰值后开始下降。细胞质内与细胞核内pGH的内化趋势相似,但内化速度上存在着明显的差异,表现在细胞质内pGH在30 min左右时内化程度达到最高,细胞核内pGH在60 min左右时达到峰值,提示GH在细胞内不同部位的结合及发挥作用存在着时间上的差异。促生长肽也存在能够与肝细胞结合并内化现象,且内化趋势相似,但内化速度有明显加快,表现为内化进入细胞质与细胞核达到最大量的时间点均为15 min左右。第三,采用透射电镜观察pGH与促生长肽内化后肝细胞的形态。结果表明:与对照组相比,pGH与促生长肽内化达到最大量时,细胞的形态及细胞膜、细胞质内各种细胞器、细胞核的形态均没有明显变化,表明pGH与促生长肽的内化,对细胞的形态结构上没有明显的影响,为进一步的亚细胞定位研究奠定试验基础。最后,采用胶体金免疫电镜法对pGH与促生长肽在肝细胞结合具体部位进行亚细胞定位观察研究。试验结果显示pGH在刺激猪肝细胞20 min之后,已经内化进入到细胞中,分别在线粒体、细胞核、粗面内质网、细胞膜部位发现存在结合现象;由结合胶体金的量多少判定结合部位的主次,依次为线粒体、细胞核、粗面内质网、细胞膜。由亚细胞定位观察试验,可判定线粒体和细胞核为pGH与肝细胞主要结合部位,并提示这也是pGH发挥作用的主要部位,该研究发现与鼠的同类研究结果相似。综上所述:pGH与促生长肽在猪肝细胞上均能够发生内化现象,且内化的整体趋势相似;通过亚细胞定位观察可知,pGH内化后的主要作用部位依次是线粒体、细胞核、粗面内质网、细胞膜。
【关键词】：猪生长激素 促生长肽 猪肝细胞 内化 亚细胞定位
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 前言9-10
• 第一篇 文献综述10-15
• 1.1 生长激素(Growth hormone, GH)10-11
• 1.2 生长激素受体11-13
• 1.3 生长激素的内化13-14
• 1.4 促生长肽简介14
• 1.5 研究目的及意义14-15
• 第二篇 研究内容15-41
• 第一章 猪肝细胞活率及其表面生长激素受体表达情况的鉴定试验15-23
• 1.1 材料与方法15-20
• 1.2 结果与分析20-22
• 1.3 讨论22
• 1.4 小结22-23
• 第二章 猪生长激素与促生长肽在猪肝细胞上的内化过程观察试验23-31
• 2.1 材料与方法23-24
• 2.2 结果与分析24-29
• 2.3 讨论29-30
• 2.4 小结30-31
• 第三章 猪生长激素与促生长肽与猪肝细胞结合的超微结构观察31-35
• 3.1 材料与方法31-32
• 3.2 结果与分析32-33
• 3.3 讨论33-34
• 3.4 小结34-35
• 第四章 猪生长激素在猪肝细胞上的亚细胞定位研究35-41
• 4.1 材料与方法35-36
• 4.2 结果与分析36-39
• 4.3 讨论39-40
• 4.4 小结40-41
• 结论41-42
• 参考文献42-50
• 作者简介50-51
• 致谢51

【参考文献】

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本文编号：731325