硫酸头孢喹肟阳离子前体脂质体的制备、表征及其体外抗金黄色葡萄球菌生物膜的研究

发布时间：2017-08-28 14:35

  本文关键词：硫酸头孢喹肟阳离子前体脂质体的制备、表征及其体外抗金黄色葡萄球菌生物膜的研究

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【摘要】：硫酸头孢喹肟为第四代动物用头孢类抗生素,因其对绝大部分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有较强的杀灭效果而常用于治疗由金黄色葡萄球菌等细菌引起的家畜呼吸道疾病以及乳房炎疾病等。有研究表明,金黄色葡萄球菌较易形成生物膜,这也是该细菌耐药性产生的原因之一。所以寻找抗金黄色葡萄球菌生物膜的新型有效制剂对该菌的防控有着至关重要的意义。本研究旨在构建硫酸头孢喹肟阳离子前体脂质体并探讨其对细菌生物膜的作用,以获得对金黄色葡萄球菌具有较好作用的硫酸头孢喹肟新制剂。通过优化硫酸头孢喹肟阳离子前体脂质体的制备工艺,并对其相关性质、体外释放以及抗金黄色葡萄球菌生物膜的效果进行考察,达到了预期研究目的。主要研究结果如下：1.建立了专属性较强的反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定硫酸头孢喹肟的体外含量。标准曲线方程为：A=51313C-22439,R2=0.9997,药物浓度在1.25～160 μg/ml之间与峰面积有较好的线性关系,回收率99.30%-101.60%,日间和日内精密度均小于5%,该方法可用于药物含量测定并排除杂质和辅料的干扰。同时,对脂质体破乳剂及低温高速离心法分离脂质体与游离药物的效果进行了考察,结果表明,加入适量的四氢呋喃可以充分破坏脂质体的磷脂双分子层结构：将脂质体溶液4℃,15000 r/min,离心1 h可以将游离药物与脂质体良好分离,且游离药物的回收率达到99.72%-101.17%,为后期制剂工艺的设计和优化打下基础。2.采用固体分散法结合泡腾水化法制备硫酸头孢喹肟阳离子前体脂质体,以包封率为主要考察指标并结合制剂外观形态,设计单因素实验以及正交实验对硫酸头孢喹肟阳离子前体脂质体的制备方法进行筛选,得到最佳处方工艺为：减压旋转蒸发温度为54℃,CC14的用量为20 ml, Tween80用量为75μ1,大豆卵磷脂与胆固醇的用量比为2：1,药物与大豆卵磷脂和胆固醇的用量比为1：10,柠檬酸与NaHCO3的用量比为5：1,药物与十八胺的用量比为1：5。此工艺下得到的脂质体平均包封率为63.21%,载药量为4.04%。3.按最佳工艺处方制备得到的硫酸头孢喹肟阳离子前体脂质体分散后为白色均匀混悬液,其平均粒径为201.5 nm, Zeta电位为65.29 mV。体外累积释放实验显示,8 h时,原料药的累计释放量达到了药物总量的97.82%,阳离子脂质体仅达到了药物总量的73.94%,这证明本试验制备得到的阳离子脂质体具有定的缓释性。溶血性试验和刺激性试验结果表明所制备脂质体无明显溶血效果和血管刺激性。药物稳定性试验证明硫酸头孢喹肟阳离子前体脂质体在高湿度和强光照射下不稳定,应干燥避光保存。4.采用二倍稀释法考察硫酸头孢喹肟溶液、硫酸头孢喹肟普通脂质体及其阳离子脂质体对金黄色葡萄球菌标准菌及10株猪源性临床分离菌的最小抑菌浓度(MIC值)。结果显示,三种制剂对金黄色葡萄球菌标准菌的MIC值依次分别为1、1.34、0.48 μg/ml,三种制剂对临床菌的MIC值均有不同程度的上升,说明临床菌有一定的耐药性,硫酸头孢喹肟阳离子脂质体对部分临床菌的MIC值小于溶液。通过分光光度计法检测了硫酸头孢喹肟溶液及其阳离子脂质体对金黄色葡萄球菌生长曲线的抑制作用,结果显示,在加入药物2h后,细菌的生长曲线开始出现差距；而同样为0.5MIC药物浓度,阳离子脂质体抑制细菌生长的效果更明显。药物浓度≥MIC值时,药物作用后的金黄色葡萄球菌生长很快进入衰亡期,药物浓度越高,进入衰亡期的时间越快,甚至跳过了细菌生长的对数期及稳定期。5.运用刚果红、结晶紫、硝酸银等方法共同鉴定了金黄色葡萄球菌标准菌及10株猪源性临床菌生物膜的形成能力。MTT法测定了药物对金黄色葡萄球菌生物膜的清除率及药物作用时间对金黄色葡萄球菌生物膜的清除效果。结果显示,11株金黄色葡萄球菌均能形成稳定的生物膜结构,其中4株细菌形成细菌生物膜的能力较强。同样为MIC药物浓度条件下,阳离子脂质体在24 h对细菌生物膜的清除效果更明显。而2.5MIC值时,其对生物膜的清除率已经达到了81.30%。同时药物浓度与细菌生物膜的清除率呈正相关,且药物对细菌生物膜的清除能力表现出了时间依赖性。环境扫描电镜图像结果表明,本试验所制得脂质体与生物膜接触后,其中的细菌数量及生物膜基质的量均有所降低,这些结果均证实阳离子脂质体制剂在抗金黄色葡萄球菌生物膜方面有一定优势。本课题研究结果表明,采用固体分散法结合泡腾水化法制备得到的硫酸头孢喹肟阳离子前体脂质体方法简便,质量可控,重现性好,包封率、载药量、粒径等指标均符合脂质体制剂要求。该制剂能够减缓体外金黄色葡萄球菌的生长速度,同时对该菌所形成的生物膜有一定的清除效果,为硫酸头孢喹肟新制剂的研发和细菌生物膜的防控提供了新思路。
【关键词】：硫酸头孢喹肟 阳离子前体脂质体 金黄色葡萄球菌 生物膜 体外
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S859.796
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-14
• 第一部分 文献综述及立题依据14-25
• 第一章 文献综述14-23
• 1 金黄色葡萄球菌生物膜的研究概述14-17
• 2 头孢喹肟的研究概况17-19
• 2.1 头孢喹肟的理化性质17-18
• 2.2 头孢喹肟的药效学研究18-19
• 2.3 头孢喹肟的制剂研究19
• 3 脂质体对细菌生物膜控制的潜在应用19-23
• 3.1 脂质体的特点19-20
• 3.2 前体脂质体的概述20-22
• 3.3 脂质体在细菌生物膜上的应用22-23
• 第二章 立题背景及目的意义23-25
• 第二部分 试验研究25-72
• 第一章 硫酸头孢喹肟含量测定方法的建立25-33
• 1 材料和方法25-28
• 1.1 试验材料25-26
• 1.2 试验方法26-28
• 2 结果和分析28-31
• 2.1 测定波长的选择28
• 2.2 方法专属性考察结果28-29
• 2.3 硫酸头孢喹肟标准曲线的建立29-30
• 2.4 加样回收率和方法回收率试验结果30-31
• 2.5 破乳剂的选择31
• 2.6 游离药物回收率的测定结果31
• 3 讨论与小结31-33
• 第二章 硫酸头孢喹肟阳离子前体脂质体的制备工艺及处方研究33-41
• 1 材料和方法33-35
• 1.1 试验材料33
• 1.2 试验方法33-35
• 2 结果和分析35-39
• 2.1 单因素试验结果35-38
• 2.2 正交试验优化工艺结果38-39
• 2.3 最佳工艺验证39
• 3 讨论和小结39-41
• 第三章 硫酸头孢喹肟阳离子脂质体的性能评价41-51
• 1 材料和方法41-44
• 1.1 试验材料41
• 1.2 试验方法41-44
• 2 结果和分析44-49
• 2.1 制剂的外观形态记录结果44
• 2.2 环境扫描电子显微镜记录结果44-45
• 2.3 制剂粒径大小、分布及Zeta电位的测定结果45
• 2.4 脂质体包封率及其载药量的测定45-46
• 2.5 药物体外累积释放考察46-47
• 2.6 溶血性试验47-48
• 2.7 家兔刺激性试验48
• 2.8 药物稳定性试验48-49
• 3 讨论与小结49-51
• 第四章 硫酸头孢喹肟阳离子脂质体体外抗金黄色葡萄球菌的研究51-57
• 1 材料和方法51-53
• 1.1 试验材料51-52
• 1.2 试验方法52-53
• 2 结果和分析53-55
• 2.1 药物抗S.aureus的MIC结果53-54
• 2.2. 不同浓度药物对S.aureus标准菌生长的抑制作用结果54-55
• 3 讨论与小结55-57
• 第五章 硫酸头孢喹肟阳离子脂质体对金黄色葡萄球菌生物膜的影响57-69
• 1 材料和方法57-60
• 1.1 试验材料57
• 1.2 试验方法57-60
• 2 结果和分析60-66
• 2.1 刚果红实验鉴定结果60
• 2.2 结晶紫染色结果60-61
• 2.3 硝酸银染色结果61
• 2.4 11株S.aureus生物膜形成能力的筛选结果61-62
• 2.5 药物抗S.aureus生物膜的活性结果62-64
• 2.6 药物作用时间不同对S.aureus标准菌生物膜的清除率64-65
• 2.7 药物对S.aureus生物膜的清除图像观察结果65-66
• 3 讨论与小结66-69
• 第六章 结论与创新69-72
• 1 结论69-71
• 2 创新71-72
• 参考文献72-81
• 致谢81-82
• 攻读学位期间发表的学术论文目录82

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本文编号：748133