大肠杆菌噬菌体LZZ-17生化特性及全基因组学研究

发布时间：2017-08-28 22:34

  本文关键词：大肠杆菌噬菌体LZZ-17生化特性及全基因组学研究

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【摘要】：【目的】噬菌体于1915年被人类首次发现,是专以细菌为宿主的病毒,由蛋白质外壳包裹的遗传物质构成,如γ噬菌体和T4噬菌体等。在进入后抗生素时代,抗生素产生的高耐药性细菌,已对人类和环境造成了严重的危害,促使寻找新的抗菌药物成为热点,噬菌体以其高度专一性、稳定性重新进入了人们的视线。噬菌体有诸多优点,其进入宿主细菌细胞后可依靠宿主菌完成自我增殖,以很小的剂量侵入就可达到增殖和溶菌的效果。细菌性感染疾病中,尤其是多重耐药菌的治疗,噬菌体有着比抗生素更巨大的优势。在杀菌方面,噬菌体裂解酶的研究越来越广泛,其可以高度纯化,拥有极高的底物特异性,不需要感染和复制,杀菌作用速率快,细菌也不易对其产生抗性。【方法】从家禽养殖场采集粪便样品,以大肠杆菌YHE-9、BBZ2-2f、BBZ6-3f和HW5-3f为宿主菌分离其噬菌体,对噬菌体分离株进行纯化增殖。以体外裂解常规稀释度(RTD)法筛选噬菌体分离株裂解性最强者,进行选出噬菌体分离株的温度稳定性、最适生长温度、最佳p H值测定、最佳感染复数测定、一步生长曲线测定、裂解谱测定。研究其生化特性,证明选出噬菌体分离株作为生物制剂的潜在性能。对选出噬菌体分离株进行全基因组测序,作序列拼接、组装结果评估、基因组结构基础特性、ORF功能预测、全基因组注释、噬菌体分离株进化分析、噬菌体分离株裂解酶等的生物信息学分析。【结果】各噬菌体分离株中以大肠杆菌YHE-9分离出的一株噬菌体LZZ-17裂解性最强;噬菌体分离株LZZ-17经纯化后,双层平板试验显示其噬菌斑清晰透亮、边缘整齐、直径在2~3mm(培养12h),初始效价为5.3×107 PFU/m L,最佳感染复数0.1,温度范围37℃~45℃、p H 7的条件下噬菌体性能表现出良好的稳定性。一步生长曲线证明,该噬菌体潜伏期为20min,裂解量60.5。拼接序列基因组长度37418bp,注释后得到71个开放阅读框(ORFs)没有发现t RNA,不包含任何抗性基因与毒力基因。扫描基因发现6个突变位点:gp5、gp6、gp40、gp63以及2个未知的基因突变。【结论】分离出大肠杆菌YHE-9的噬菌体LZZ-17,具有较强的裂解能力,杀菌效果明显,各生化性能指标表明该噬菌体可作为生物制剂应用。基因组学研究发现,在基因组成和结构方面,大多数必需基因都是高度保守的,但也存在着一些基因的点突变,目前并不清楚这些突变会对噬菌体造成何种影响。
【关键词】：大肠杆菌 噬菌体 裂解酶 生化特性 全基因组测序 生物信息学分析
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要3-4
• Summary4-7
• 缩略词中英文对照表7-8
• 第一章 绪论8-17
• 1.1 噬菌体对抗多重耐药病原体的生物工具8-9
• 1.2 噬菌体的发现到应用9-10
• 1.3 噬菌体疗法10-11
• 1.4 噬菌体展示11-12
• 1.5 γ噬菌体DNA复制及裂解性12-13
• 1.5.1 λ噬菌体DNA复制12-13
• 1.5.2 γ噬菌体裂解性13
• 1.6 T4噬菌体DNA复制及裂解性13-15
• 1.6.1 T4噬菌体DNA复制13-14
• 1.6.2 T4噬菌体裂解性14-15
• 1.7 研究的目的及意义15
• 1.8 研究内容和方法15-17
• 1.8.1 噬菌体的分离选择15
• 1.8.2 噬菌体生化特性及基因组研究15-17
• 第二章 大肠杆菌噬菌体的分离及纯化17-25
• 2.1 材料与方法17-20
• 2.1.1 材料17-18
• 2.1.2 方法18-20
• 2.2 结果20-23
• 2.2.1 噬菌体的分离结果20-21
• 2.2.2 噬菌体的纯化21
• 2.2.3 噬菌体效价的测定21
• 2.2.4 噬菌体宿主范围筛选21-22
• 2.2.5 噬菌体的体外裂解实验22-23
• 2.2.6 噬菌体的常规稀释度（RTD）的测定23
• 2.2.7 强裂解性噬菌体的筛选23
• 2.3 讨论23-25
• 第三章 噬菌体LZZ-17生物学特性研究25-30
• 3.1 材料与方法25-26
• 3.1.1 材料25
• 3.1.2 方法25-26
• 3.2 结果26-28
• 3.2.1 噬菌体的最适生长温度26
• 3.2.2 噬菌体热稳定性分析26-27
• 3.2.3 噬菌体最适PH值分析27
• 3.2.4 噬菌体最佳感染复数的测定结果27-28
• 3.2.5 噬菌体一步生长曲线的绘制28
• 3.2.6 噬菌体保存方法比较结果28
• 3.3 讨论28-30
• 第四章 噬菌体LZZ-17全基因组生物信息学研究30-43
• 4.1 材料和方法30-33
• 4.1.1 材料30
• 4.1.2 方法30-31
• 4.1.3 LZZ-17全基因组Illumina Hise测序31-33
• 4.2 结果33-41
• 4.2.1 组装结果评估33
• 4.2.2 噬菌体LZZ-17基因组结构的一般特征33
• 4.2.3 噬菌体LZZ-17基因组ORF分析33-35
• 4.2.4 噬菌体全基因注释分析35-38
• 4.2.5 噬菌体LZZ-17系统发生树分析38
• 4.2.6 噬菌体LZZ-17裂解酶的生物信息学分析38-39
• 4.2.7 噬菌体LZZ-17突变位点分析39-41
• 4.3 讨论41-43
• 结论43-44
• 致谢44-45
• 参考文献45-50
• 作者简介50-51
• 导师简介51-52

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