小反刍兽疫及水泡性口炎病毒N蛋白表达及应用

发布时间：2017-08-29 23:41

  本文关键词：小反刍兽疫及水泡性口炎病毒N蛋白表达及应用

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【摘要】：小反刍兽疫(Peste des petits ruminants, PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus, PPRV)引起的以发热、口炎、腹泻、肺炎为主要特征的一种急性传染病,PPRV基因组为有囊膜的多形性单股无节段负链RNA,编码6种结构蛋白(N、M、 P、L、F和H蛋白),其中N蛋白是PRRV核衣壳蛋白,也是主要结构蛋白,是PPRV抗原性最稳定、含量最高的蛋白,动物感染PPRV后可迅速产生针对N蛋白的高滴度抗体,虽然该抗体不具有中和病毒的活性,但抗体维持时间较长。水泡性口炎(Vesicular Stomatitis, VS)是由水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus, VSV)引起多种动物感染易感的以舌、唇、口腔黏膜、乳头和蹄冠等处上皮发生水泡样病变为主要特征的一种急性、高度接触性传染病,VSV基因组为线状单股负链RNA,从3”到5'端依次编码了N蛋白、P蛋白、M蛋白、G蛋白和L蛋白,其中其中N蛋白能保护病毒免受核糖核酸酶的降解,在病毒的复制及转录过程中起着很关键的作用,且N蛋白具有高度保守性,VSV所有型之间均具有交叉保护性。鉴于此,本研究对PPRV和VSV N蛋白进行了原核表达,并对表达的蛋白进行了应用,即利用纯化后的PPRV N蛋白建立了PPRV间接ELISA抗体检测方法；利用纯化后的VSV N蛋白制备了VSV单克隆抗体。旨在为PPRV的临床诊断、流行病学调查、疫苗免疫效果监测等提供一种简单、快速、敏感、特异的血清学诊断方法；为VSV发病机理研究和VSV抗原诊断试剂的研制奠定基础。参照GenBank中已发表的PPRV基因组N基因序列,设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增了长约1500 bp的N基因片段,将目的片段亚克隆至pCold I原核表达载体中,经IPTG诱导重组N蛋白的表达,重组蛋白经亲和层析法纯化后,Western-Blotting检测证明具有重组蛋白良好的免疫原性。以重组N蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测PPRV抗体的间接ELISA诊断方法,该方法检测口蹄疫病毒、羊痘病毒、伪狂犬病毒阳性血清均为阴性；该方法重复性试验的变异系数小于10%;该方法与进口小反刍兽疫血清抗体检测试剂盒的符合率为达98.3%。参照GenBank中已发表的VSV基因组N基因序列,分别合成VSV不同血清型的N基因,经序列对比分析后,设计合成1对特异性引物,PCR扩增了长约1200 bp的N基因片段,将目的片段亚克隆至pCold I原核表达载体中,经IPTG诱导重组N蛋白的表达,重组蛋白经亲和层析法纯化后,Western-Blotting检测证明具有重组蛋白良好的反应性。以重组N蛋白为免疫原免疫6周龄BALB/c雌鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA筛选获得了3株稳定分泌VSV特异性抗体的杂交瘤细胞株,间接免疫荧光试验表明3株单克隆抗体均可与VSV发生特异性反应。综上,本研究利用原核表达技术表达的PPRV N蛋白具有良好反应活性,以纯化的重组N蛋白为包被抗原建立的PPRV间接ELISA抗体监测方法具有良好的敏感性、特异性、重复性和准确性,为PPRV抗体检测、临床诊断、流行病学调查以及疫苗免疫效果监测等提供了一种简便、快速、高通量的血清学检测方法。利用原核表达技术表达的VSV N蛋白具有良好的免疫原性,以纯化的重组N蛋白为免疫原,制备的3株抗VSV单克隆抗体具有良好的免疫原性,为建立以单克隆抗体为基础的免疫学检测试剂盒的研制与应用奠定了基础。
【关键词】：小反刍兽疫病毒 水泡性口炎病毒 原核表达 间接ELISA 单克隆抗体
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S855.3
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 引言13-14
• 1 文献综述14-24
• 1.1 小反刍兽疫14-16
• 1.1.1 小反刍兽疫概述14
• 1.1.2 小反刍兽疫临床症状14
• 1.1.3 流行病学14-15
• 1.1.4 小反刍兽疫的诊断15
• 1.1.5 小反刍兽疫预防措施15-16
• 1.2 小反刍兽病毒16-18
• 1.2.1 病毒形态特征16
• 1.2.2 病毒的理化特征16
• 1.2.3 病毒的血凝性16
• 1.2.4 病毒的结构16-18
• 1.3 水泡性口炎18-20
• 1.3.1 水泡性口炎概述18
• 1.3.2 临床症状18-19
• 1.3.3 水泡性口炎的流行病学19
• 1.3.4 水泡性口炎的诊断19-20
• 1.3.5 防制措施20
• 1.4 水泡性口炎病毒20-22
• 1.4.1 水泡性口炎病毒概述20
• 1.4.2 VSV的基因组结构20-21
• 1.4.3 VSV N基因21-22
• 1.4.4 VSV对宿主细胞的影响22
• 1.5 研究目的、意义和内容22-24
• 1.5.1 研究目的意义22
• 1.5.2 研究方法及内容22-24
• 2 小反刍兽疫N蛋白的原核表达及免疫原性分析24-35
• 2.1 实验材料与试剂24-25
• 2.1.1 菌毒株、载体24
• 2.1.2 主要试剂及工具酶24
• 2.1.3 培养基24-25
• 2.1.4 溶液25
• 2.1.5 仪器与设备25
• 2.2 实验方法25-30
• 2.2.1 病毒RNA的提取25-26
• 2.2.2 RT-PCR扩增目的片段26-27
• 2.2.3 目的基因克隆27-29
• 2.2.4 N基因的序列测定与分析29
• 2.2.5 PPRV分子特征分析29
• 2.2.6 重组质粒诱导表达条件的优化29
• 2.2.7 SDS-PAGE分析29
• 2.2.8 重组目的蛋白的纯化29-30
• 2.2.9 Western blot鉴定分析30
• 2.3 结果30-34
• 2.3.1 RT-PCR扩增结果30
• 2.3.2 N基因序列分析结果30-31
• 2.3.3 PPRV N蛋白二级结构分析31-32
• 2.3.4 重组表达质粒的构建与鉴定32
• 2.3.5 诱导表达条件的优化结果32
• 2.3.6 N基因的诱导表达及纯化32-33
• 2.3.7 N蛋白Western-Blotting免疫活性分析33-34
• 2.4 讨论34
• 2.5 小结34-35
• 3 小反刍兽疫N蛋白间接ELISA方法的建立35-42
• 3.1 实验材料35
• 3.1.1 主要试剂和血清35
• 3.1.2 主要仪器与设备35
• 3.2 实验方法35-37
• 3.2.1 抗原最佳包被度和血清最佳稀释度的确定35
• 3.2.2 抗原最佳包被条件的确定35-36
• 3.2.3 最佳二抗工作浓度的确定36
• 3.2.4 ELISA方法初步建立36
• 3.2.5 ELISA临界值的确定36
• 3.2.6 特异性试验36-37
• 3.2.7 敏感性试验37
• 3.2.8 重复性试验37
• 3.2.9 对比试验37
• 3.3 结果37-40
• 3.3.1 最佳工作浓度37-38
• 3.3.2 抗原最佳包被条件38
• 3.3.3 临界值的确定38-39
• 3.3.4 特异性试验39
• 3.3.5 敏感性试验39
• 3.3.6 重复性试验39-40
• 3.3.7 对比试验40
• 3.4 讨论40-41
• 3.5 小结41-42
• 4 VSV-IND型和VSV-NJ型的N基因克隆及原核表达42-50
• 4.1 实验材料试剂42
• 4.2 实验方法42-43
• 4.2.1 基因的合成42
• 4.2.2 表达引物的设计与合成42
• 4.2.3 目的基因扩增及原核表达载体的构建42-43
• 4.2.4 基因序列及其同源性分析43
• 4.2.5 重组质粒的诱导表达43
• 4.2.6 SDS-PAGE分析43
• 4.2.7 Western bolt鉴定分析43
• 4.2.8 VSV N蛋白的纯化43
• 4.3 结果43-48
• 4.3.1 序列分析43
• 4.3.2 N基因的理化性质43-44
• 4.3.3 N基因酶切鉴定44-45
• 4.3.4 重组表达质粒的鉴定45-46
• 4.3.5 N基因表达及蛋白纯化46-47
• 4.3.6 N蛋白Western-Blotting免疫活性分析47-48
• 4.4 讨论48-49
• 4.5 小结49-50
• 5 VSV N基因单克隆抗体的制备和特性分析50-56
• 5.1 实验材料与试剂50
• 5.1.1 主要试剂50
• 5.1.2 仪器设备50
• 5.1.3 动物和细胞株50
• 5.2 实验方法50-52
• 5.2.1 抗原的制备50-51
• 5.2.2 动物免疫51
• 5.2.3 间接ELISA检测方法的建立51
• 5.2.4 细胞融合与阳性克隆筛选51
• 5.2.5 腹水制备及单克隆抗体纯化51-52
• 5.2.6 单克隆抗体的滴度测定52
• 5.2.7 间接荧光抗体试验52
• 5.3 结果52-54
• 5.3.1 细胞融合及筛选结果52
• 5.3.2 腹水的制备及单克隆抗体纯化52-53
• 5.3.3 单克隆抗体滴度53
• 5.3.4 间接免疫荧光试验53-54
• 5.4 讨论54-55
• 5.5 小结55-56
• 结论56-57
• 参考文献57-65
• 附录1 PPRV-N核苷酸及氨基酸序列65-66
• 附录2 VSV-IDN-N核苷酸及氨基酸序列66-68
• 附录3 VSV-NJ-N核苷酸及氨基酸序列68-70
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况70-71
• 致谢71-72

【参考文献】

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本文编号：756099