组成型表达猪抗菌肽PF1-PR39的重组干酪乳杆菌构建及生物学活性分析

发布时间：2017-09-11 15:26

  本文关键词：组成型表达猪抗菌肽PF1-PR39的重组干酪乳杆菌构建及生物学活性分析

  更多相关文章： 猪抗菌肽PR39、PF1 干酪乳杆菌 组成型表达 生物学活性

【摘要】：抗菌肽普遍存在于生物界,除具有广谱的抗菌活性,其对病毒、真菌、寄生虫和原虫以及癌细胞也有一定的抑制作用,在天然免疫机制中发挥着重要作用。抗菌肽PR39、PF1是Cathelicidin家族的成员,富含脯氨酸。乳酸杆菌是可以定植于肠道的益生菌,它作为宿主菌表达外源蛋白具有其他原核或真核细胞不具备的优势。本研究以GenBank发表的猪抗菌肽PF1和PR39基因为模板,设计一段重组基因序列,用刚性linker连接两段抗菌肽基因,并在序列前端添加了用于检测蛋白表达的myc蛋白标签,依据乳酸杆菌的密码子偏嗜性进行了优化,合成了一段基因PF1-PR39。以合成基因为模板,利用P1、P2引物扩增基因并替换其酶切位点为Bam H I和Xho I,并将其克隆在p MD19-T Simple载体上。通过Bam H I和Xho I双酶切,回收PF1-PR39目的基因片段并将其克隆到PPH-pPG612组成型表达载体上。重组获得的阳性质粒通过电转化转入干酪乳杆菌ATCC L.casei 393,获得能够组成型表达猪源抗菌肽PF1-PR39的重组干酪乳杆菌PPH-pPG612-PF1-PR39/L393。以Western-blot和间接免疫荧光的方法检测重组抗菌肽的表达,并对培养条件进行探索。用动态生长曲线法和琼脂孔穴扩散法检测重组蛋白对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞杆菌的抑制活性。结果表明,重组猪抗菌肽PF1-PR39在重组菌中获得正确表达,表达产物的分子量约为17.8 k Da。重组猪抗菌肽PF1-PR39对大肠埃希氏菌、巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、和铜绿假单胞菌具有一定的抗菌效果,对李斯特菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用不明显。为检测表达猪抗菌肽的重组菌对动物生长的促进作用,选取4-5周龄清洁级BABL/c雌性小鼠,体重14~17g,随机分成3组,每组15只小鼠。试验组小鼠每天灌服200μL 1×109 CFU重组干酪乳杆菌PPH-pPG612-PF1-PR39/L393菌液;空载体组灌服200μL 1×109 CFU PPH-pPG612/L393菌液;培养基组每天灌服200μL MRS培养基,连续灌服21天。在实验前和第7、14、21天对各组小鼠的体重进行称重,计算各组平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和各个时期的料重比(F/G)。在实验的第7、14天,分别对每组小鼠进行尾部采血;在第21天,每组随机选3只小鼠脱颈致死,眼球采血,取小肠肠段并刮取其肠黏液。以小肠组织提取总RNA,用实时荧光定量PCR的方法检测相应细胞因子的表达水平。ELISA方法检测各时段的血液样本中免疫球蛋白Ig G、Ig M含量,以及肠黏液中sIg A的含量。各组余下的小鼠再平均分为2组,分别口服感染一定剂量的产肠毒素大肠埃希氏菌和鼠伤寒沙门氏菌,然后分别观测重组菌对感染后小鼠的保护作用并检测其排菌情况。结果表明,灌服表达猪抗菌肽PF1-PR39重组菌的小鼠平均日增重有极显著的提高(P0.01),料重比也有显著降低(P0.05);实验组小鼠血液中白细胞、淋巴细胞数和淋巴细胞比率与培养基组比较有所增加,但差异不显著;灌服表达重组抗菌肽的小鼠血清中Ig G、Ig M浓度比其余小鼠增高,其中IgM变化显著(P0.05),肠黏液中s Ig A含量略有提升但变化不明显;以小鼠小肠组织RNA反转录后的c DNA为模板,实时荧光定量PCR结果显示,PPH-pPG612-PF1-PR39/L393组小鼠TGF-β表达水平有较明显的提高,TNF-α水平也有所提高,IFN-γ、IL-4、IL-6的表达水平下降,但有的差异并不显著;灌服表达PF1-PR39的重组菌的小鼠对感染产肠毒素大肠埃希氏菌和沙门氏菌的小鼠具有一定程度的保护效应,死亡率下降,保护率分别达到83.3%和66.7%。综上,本研究所构建的组成型表达猪抗菌肽PF1-PR39的重组干酪乳杆菌在体外具有一定的抑菌活性;重组菌用来饲喂小鼠可以提高小鼠的生长性能,提高了非特异性免疫的功能,对感染致病菌的小鼠有一定的保护作用,这为表达抗菌肽PF1-PR39的重组干酪乳杆菌可以作为微生态制剂应用于养殖业的生产提供了依据。
【关键词】：猪抗菌肽PR39、PF1 干酪乳杆菌 组成型表达 生物学活性
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.6
【目录】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 前言12-20
• 1.1 抗菌肽结构与特性的研究进展12-15
• 1.1.1 抗菌肽的来源12-13
• 1.1.2 抗菌肽的结构特征13-14
• 1.1.3 猪源抗菌肽的分类及其特性14-15
• 1.2 抗菌肽的生物学功能15-17
• 1.2.1 抗细菌的功能15-16
• 1.2.2 抗病毒和抗肿瘤的功能16
• 1.2.3 抗真菌的功能16
• 1.2.4 抗寄生虫和原虫的功能16
• 1.2.5 免疫调节功能16-17
• 1.3 PR39、PF1的结构及抗菌特性和机制17-18
• 1.4 乳酸菌的益生特性和作为基因工程宿主菌的研究进展18-19
• 1.5 研究目的与意义19-20
• 2 材料与方法20-34
• 2.1 材料20-22
• 2.1.1 菌种与质粒20
• 2.1.2 实验动物20
• 2.1.3 引物20
• 2.1.4 抗体和主要生化试剂20-21
• 2.1.5 主要实验仪器与设备21-22
• 2.2 试验方法22-34
• 2.2.1 猪抗菌肽PF1-PR39基因序列的获得22-25
• 2.2.2 组成型表达猪抗菌肽PF1-PR39重组干酪乳杆菌的构建25-28
• 2.2.3 重组干酪乳杆菌的表达与鉴定28-29
• 2.2.4 重组干酪乳杆菌体外抑菌活性检测29-30
• 2.2.5 重组干酪乳杆菌饲喂小鼠体内生物学活性检测30-33
• 2.2.6 统计学分析33-34
• 3 结果34-47
• 3.1 猪抗菌肽PF1-PR39基因序列的获得34-35
• 3.1.1 合成基因PF1-PR39的PCR扩增结果34
• 3.1.2 重组质粒pMD19-Ts-PF1-PR39的鉴定结果34-35
• 3.2 重组质粒PPH-PPG612-PF1-PR39的鉴定结果35-36
• 3.3 重组干酪乳杆菌的构建和鉴定36-37
• 3.4 重组干酪乳杆菌的表达鉴定37-38
• 3.4.1 重组菌表达蛋白的Western-blot检测37
• 3.4.2 间接免疫荧光鉴定重组蛋白的表达37-38
• 3.5 重组干酪乳杆菌的体外抑菌试验结果38-40
• 3.5.1 动态生长曲线法测量抑菌活性38-39
• 3.5.2 琼脂孔穴扩散法测量抑菌活性39-40
• 3.6 重组干酪乳杆菌对小鼠生理功能的影响40-47
• 3.6.1 重组干酪乳杆菌对小鼠生长性能的影响40-41
• 3.6.2 重组干酪乳杆菌对小鼠免疫学指标和血液生理指标的影响41-43
• 3.6.3 小鼠体内抗致病菌感染的保护性实验结果43-47
• 4 讨论47-51
• 4.1 猪抗菌肽PF1-PR39在干酪乳杆菌中的表达47-48
• 4.2 重组干酪乳杆菌体外抑菌效果评价48
• 4.3 重组干酪乳杆菌对小鼠生长性能的影响48-49
• 4.4 重组干酪乳杆菌对小鼠的免疫调节作用49-50
• 4.5 表达PF1-PR39的重组干酪乳杆菌作为饲料添加剂的应用前景50-51
• 5 结论51-52
• 致谢52-53
• 参考文献53-60
• 附录60-64
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文64

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 吴润;邢丽丽;郝葆青;宋慧;;抗菌肽的研究进展[J];西南民族大学学报(自然科学版);2005年S1期

2 张召兄;潘晓亮;任耀军;;抗菌肽概述及抗菌分子机理的研究进展[J];草食家畜;2006年04期

3 李明魁;郭菊;张遂平;;抗菌肽的研究与应用[J];现代畜牧兽医;2007年01期

4 张兰廷;刘忠渊;张富春;;抗菌肽结构与功能关系及分子改造研究进展[J];生物技术;2008年05期

5 廖世奇;周思彤;曾家豫;;生物抗菌肽的研究进展[J];甘肃医药;2009年01期

6 谭显胜;李巍巍;王志明;袁哲明;;抗菌肽的研究进展[J];现代生物医学进展;2009年16期

7 李书伟;晏家友;;抗菌肽的研究进展[J];四川畜牧兽医;2010年05期

8 朱鑫;马清泉;董娜;单安山;;改良型抗菌肽的研究进展[J];生物化学与生物物理进展;2012年09期

9 蔡灵;;抗菌肽来源及其应用进展[J];安徽农业科学;2013年13期

10 梁世德,张士璀;抗菌肽和抗菌肽基因[J];海洋科学;1994年06期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 徐家萍;王成林;杨莹;尤征英;;多功能抗菌肽及其分子改造的研究进展[A];华东·华中地区第十二次蚕种学术研讨会论文集[C];2010年

2 孙振钧;;蚯蚓抗菌肽研究进展[A];畜牧业环境、生态、安全生产与管理——2010年家畜环境与生态学术研讨会论文集[C];2010年

3 尚德静;白冰;李晓帆;付欣;郑俊杰;;中国林蛙(Rana chensinensis)皮肤抗菌肽基因和功能多样性研究[A];“基因、进化与生理功能多样性”海内外学术研讨会暨中国生理学会第七届比较生理学学术会议论文摘要[C];2009年

4 黄自然;黄亚东;温刘发;郑青;廖富频;胡建雄;黄国庆;姜丽华;黄永彤;李运南;梁淑娃;彭中建;董加喜;夏枫耿;陈松彬;;抗菌肽生物工程及其应用[A];全国桑树种质资源及育种和蚕桑综合利用学术研讨会论文集[C];2005年

5 廖富，

本文编号：831528