一株O60血清型鸭大肠埃希菌的分离鉴定及耐药性分析

发布时间：2017-09-25 21:15

  本文关键词：一株O60血清型鸭大肠埃希菌的分离鉴定及耐药性分析

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【摘要】：禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠埃希菌(APEC)引起的,以大肠杆菌性肉芽肿、腹膜炎、输卵管炎、心包炎,肝周炎为特征。大肠埃希菌有鞭毛,能运动、为中等大小的无芽孢的革兰阴性杆菌。近年来关于禽大肠杆菌病的报道越来越多,禽大肠杆菌病发病率高,流行范围广,虽然病死率不高,但是对生产造成了严重的影响。引起禽大肠杆菌病的禽致病性大肠埃希菌血清型众多且分布范围广,再加之我国养禽业基数大,饲养管理粗放,导致禽大肠杆菌病成为了养禽业的一种常发病。由于抗菌药物的滥用,使得禽致病性大肠埃希菌的耐药谱很广,这对禽大肠杆菌病的防治造成了很大的影响。本研究从潼关县某发病鸭场采集病料进行病原的分离鉴定,并对其进行耐药性分析,为鸭大肠杆菌病的防制提供重要的理论依据。1.采集潼关县某鸭场疑似禽大肠埃希菌感染的病鸭的病变组织进行病原的分离鉴定,用无菌操作法将病变组织涂布于麦康凯琼脂培养基与普通琼脂培养基,37℃培养24 h,在普通琼脂培养基上生成圆形凸起、半透明、浅灰色、湿润的,光滑的菌落。在麦康凯琼脂培养基上生成圆形凸起、湿润的、光滑的,粉红色的菌落。挑取单菌落进行革兰染色并在显微镜下观察到革兰染色阴性的中等大小的无芽孢的杆菌。将分离菌的纯培养物接种于普通琼脂斜面培养基、邓亨氏蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水,37℃培养24 h后,用接种环在普通琼脂斜面挑取少量菌落接种于生化鉴定管内,37℃培养24 h,结果显示,分离菌能发酵葡萄糖和乳糖、靛基质阳性、MR阳性、VP阴性。将分离菌用细菌通用引物通过PCR进行16S rRNA基因序列扩增后,切下目的条带并进行回收,将胶回收PCR产物通过连接至pMD19-T克隆载体、转化入DH5α感受态细胞,挑取单克隆进行PCR扩增,对鉴定为阳性的单克隆进行送测。测序结果显示,该分离菌的16S rRNA基因片段大小为1534 bp,与大肠埃希菌标准株的基因序列的相似度为99%。综合判定该分离株为大肠埃希菌,并命名为TG-2015。遗传进化分析结果表明TG-2015分离株处于一个相对独立的分支。2.将分离菌的纯培养物接种于普通琼脂斜面,37℃培养24 h。用少量的5%石碳酸生理盐水冲洗斜面,将洗下的悬液2000 r/min离心5 min。然后将上悬液放入另一离心管内,8000 r/min,离心10 min。弃去上悬液,将沉淀配制成菌悬液,121℃灭菌2 h,将K抗原破坏后所制备的抗原为O抗原。将不同型的抗“O”血清用无菌生理盐水稀释8倍后,分别滴加25μL于玻片上,再滴加25μL O抗原与之混合,30s内出现凝集则为阳性,经鉴定TG-2015的血清型为O60。3.将分离菌的纯培养物接种于普通琼脂斜面培养基,37℃培养24 h,用生理盐水配制成1×109CFU/mL的悬液。分别腹腔接种6只小白鼠和6只雏鸭,0.2 mL/只。用灭菌生理盐水接种3只小鼠和3只雏鸭,作为阴性对照。在接种后24 h内,实验组动物全部死亡,对照组全部存活。结果表明分离株TG-2015具有较强的致病性。4.将分离菌的纯培养物接种于麦康凯琼脂培养基,37℃培养24 h后,在无菌操作台中用挑菌环挑取典型的单菌落配制成1×108 CFU/mL~2×108 CFU/mL的菌液,用吸管吸取少量的菌液然后均匀的涂布在MH琼脂培养基上,将培养基放置5 min左右,然后用镊子夹取药敏纸片均匀的贴在培养基表面,每个MH琼脂培养基贴4个药敏纸片(共33个),将贴好的MH琼脂培养基放置于培养箱内37℃培养16 h。结果表明TG-2015对试验所用的33种药敏纸片中的25种耐药,8种敏感。将对该分离株敏感的阿米卡星用于鸭场病鸭的治疗,病鸭在用药后7d康复,产蛋率恢复正常。综上所述,本研究所分离的鸭大肠埃希菌TG-2015的血清型O60在我国属于不常见血清型,致病力强,遗传进化处于单独的分支,耐药谱较为广泛。
【关键词】：鸭大肠埃希菌 分离鉴定 血清型 耐药性
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 文献综述12-23
• 第一章 禽大肠杆菌病的研究进展12-23
• 1.1 病原学12-13
• 1.1.1 形态特征12-13
• 1.1.2 培养特性13
• 1.1.3 分离鉴定13
• 1.1.4 抗原结构与血清型13
• 1.1.5 大肠埃希菌生化特性13
• 1.1.6 抵抗力13
• 1.1.7 致病性13
• 1.2 流行病学13-14
• 1.2.1 传染源14
• 1.2.2 传播途径14
• 1.2.3 易感动物14
• 1.3 致病机理14
• 1.4 致病因子14-16
• 1.4.1 黏附素14-15
• 1.4.2 摄铁系统(Fur)15
• 1.4.3 溶血素15
• 1.4.4 抗血清存活因子15-16
• 1.4.5 毒素16
• 1.5 临床症状与病理变化16-17
• 1.5.1 临床症状16-17
• 1.5.2 病理变化17
• 1.6 诊断17-18
• 1.6.1 病原学诊断17
• 1.6.2 血清型鉴定17-18
• 1.7 防治措施18-19
• 1.7.1 预防18
• 1.7.2 治疗18-19
• 1.8 国内不同地区血清型分布19
• 1.9 禽大肠埃希菌耐药性研究进展19-23
• 1.9.1 耐药性的产生机制19-20
• 1.9.2 耐药性现状20-21
• 1.9.3 研究耐药性的意义21-23
• 试验研究23-36
• 第二章 鸭大肠埃希菌的分离鉴定及耐药性分析23-36
• 2.1 材料23-24
• 2.1.1 病料23
• 2.1.2 实验动物23
• 2.1.3 主要试剂23-24
• 2.1.4 主要培养基24
• 2.1.5 常用培养基与试剂的配制24
• 2.1.6 引物24
• 2.1.7 主要仪器设备24
• 2.2 方法24-27
• 2.2.1 细菌分离培养24
• 2.2.2 染色镜检24
• 2.2.3 生化试验24-25
• 2.2.4 血清型鉴定试验25
• 2.2.5 大肠埃希菌 16S rRNA基因的扩增25
• 2.2.6 目的基因的克隆25-26
• 2.2.7 致病性试验26-27
• 2.2.8 药敏试验27
• 2.3 结果27-33
• 2.3.1 分离培养27
• 2.3.2 分离菌株的染色镜检27-28
• 2.3.3 分离菌株的生化鉴定28-29
• 2.3.4 16S rRNA基因片段PCR扩增29
• 2.3.5 测序29-30
• 2.3.6 遗传进化分析30
• 2.3.7 血清型鉴定试验30
• 2.3.8 动物致病性试验30-31
• 2.3.9 药敏试验31-33
• 2.4 讨论33-35
• 2.4.1.关于病原菌的分离培养及鉴定33
• 2.4.2 血清型鉴定33-34
• 2.4.3 耐药性分析34-35
• 2.5 小结35-36
• 结论36-37
• 参考文献37-41
• 附录41-48
• 缩略词表48-49
• 致谢49-50
• 作者简介50

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本文编号：919616