白介素12真核表达质粒及电穿孔对新城疫F基因DNA疫苗的免疫增强作用研究

发布时间：2017-09-28 16:05

  本文关键词：白介素12真核表达质粒及电穿孔对新城疫F基因DNA疫苗的免疫增强作用研究

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【摘要】：新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的一种高度接触性、高死亡的禽类传染病,是危害养禽业的重要疫病。随着近几年基因Ⅶ型毒株的流行,使用传统灭活苗和弱毒苗往往不能取得理想的免疫效果。因此,开展新城疫基因工程疫苗的研究具有重要的意义。DNA疫苗被称为“第三代疫苗”,能够刺激机体同时产生体液免疫和细胞免疫反应,而且持续时间长,是最具有潜力的基因工程苗之一。为了深入研究新城疫DNA疫苗,本研究利用含β-actin启动子和CMV增强子的载体质粒pCAGGS成功构建了真核表达质粒pCAG-F和pCAG-IL12,通过电穿孔导入的方式将质粒输送到动物体内,研究电穿孔免疫方式和鸡IL12重组表达质粒共免疫方式对pCAG-F DNA疫苗免疫原性的增强作用。首先,以基因Ⅶ型新城疫病毒CHICKEN/CH/GD/GM-03作为F基因的供体,在上游引入Kozak序列,构建出pCAG-F真核表达质粒,分别以电穿孔或者普通肌肉注射的方式免疫SPF鸡群,通过检测机体的体液免疫和细胞免疫应答水平,综合评价电穿孔技术对新城疫DNA疫苗免疫原性的增强作用,并通过免疫保护试验对疫苗效果进行评估。血清抗体中和试验结果显示:在二免后2周pCAG-F/EP组的针对NDV GM株的中和抗体滴度高于pCAG-F/IM组。MTT法检测免疫鸡外周血T淋巴细胞增殖试验,结果显示:pCAG-F/IM组和EP组T淋巴细胞对CoA的刺激均有明显的反应性。二免后14 d,pCAG-F/IM组T细胞CoA刺激的OD值和对照组相比差异显著(P0.05),而EP组T细胞CoA刺激的OD值和对照组相比差异极显著(P0.001)。试验结果表明电穿孔的免疫方式能够显著增强新城疫F基因DNA疫苗的体液免疫和细胞免疫应答水平。二免后14 d进行新城疫病毒强毒攻击,pCAG-F/IM组存活率为90%,表明F基因作为新城疫基因的免疫原基因具有可行性。pCAG-F/EP组存活率为100%,说明电穿孔的免疫方式能够增强pCAG-F的攻毒保护效果。拭子病毒分离的结果表明,电穿孔的免疫方式能够降低排毒率和缩短排毒时长。其次,构建表达鸡源IL-12的真核表达质粒,在电穿孔技术的基础上,进一步探讨分子佐剂IL-12对新城疫F基因DNA疫苗的免疫增强作用。血清中和抗体试验结果显示:在三免后2周pCAG-F+pCAG-IL12/EP组和pCAG-F/EP组相比,中和抗体差异极显著(P0.01)。MTT法检测免疫鸡外周血T淋巴细胞增殖试验,结果显示:二免后14 d,pCAG-F/EP组T细胞CoA刺激的OD值和对照组相比差异极显著(P0.01),pCAG-F+pCAG-IL12/EP组T细胞CoA刺激的OD值和对照组相比差异极显著(P0.001)。pCAG-F+pCAG-IL12/EP组和pCAG-F/EP组相比T细胞CoA刺激的OD值差异显著(P0.05)。结果表明,pCAG-IL12质粒能够增强新城疫重组DNA疫苗pCAG-F的体液和细胞免疫应答。拭子病毒分离的结果表明,pCAG-F+pCAG-IL12/EP组仅第3 d时,有1只鸡(1/10)喉头可分离到病毒,这说明共免疫pCAG-IL12对重组DNA疫苗pCAG-F具有较明显的免疫增强作用,能够有效地抑制病毒在机体内的复制和排毒。综上,本研究制备了新城疫病毒F基因DNA疫苗,并评估了电穿孔基因导入技术和使用pCAG-IL12质粒作为佐剂均对新城疫pCAG-F DNA疫苗的免疫效果的影响,为新一代新城疫DNA疫苗的研制提供了新的思路和方向。
【关键词】：新城疫 DNA疫苗 F基因 电穿孔 白介素12
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S855.3
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 缩略语表(Abbreviation)7-11
• 1 前言11-22
• 1.1 新城疫及新城疫病毒概述11-13
• 1.1.1 新城疫概述11
• 1.1.2 新城疫病毒结构蛋白及功能11-13
• 1.2 新城疫疫苗研究进展13-18
• 1.2.1 活疫苗13-14
• 1.2.2 灭活疫苗14
• 1.2.3 亚单位疫苗14-15
• 1.2.4 活载体疫苗15-16
• 1.2.5 病毒样颗粒疫苗16-17
• 1.2.6 反向遗传疫苗17
• 1.2.7 DNA疫苗17-18
• 1.3 DNA疫苗优化策略18-21
• 1.3.1 密码子优化18-19
• 1.3.2 优化载体19-20
• 1.3.3 选用合适的分子佐剂20
• 1.3.4 优化接种途径与接种方法20-21
• 1.4 IL-12作为免疫佐剂的作用及应用21
• 1.5 本研究的目的和意义21-22
• 2 材料与方法22-33
• 2.1 材料22-24
• 2.1.1 病毒、质粒和菌株22
• 2.1.2 实验动物及攻毒试验场所22
• 2.1.3 主要试剂22-23
• 2.1.4 分子生物学软件23
• 2.1.5 常用试剂的配制23-24
• 2.1.6 主要仪器和设备24
• 2.2 方法24-30
• 2.2.1 鸡IL-12基因及新城疫F基因的克隆24-27
• 2.2.2 pCA-F和pCA-IL12质粒的构建、鉴定和准备27-29
• 2.2.3 通过间接免疫荧光检测目的蛋白表达29-30
• 2.3 攻毒保护实验30-33
• 2.3.1 SPF鸡的免疫30-32
• 2.3.2 血清中和试验32-33
• 2.3.3 淋巴细胞增殖试验33
• 2.3.4 病毒分离33
• 3 结果与分析33-43
• 3.1 鸡IL-12基因和GM株F基因扩增结果33-34
• 3.2 表达质粒的构建和鉴定34-36
• 3.2.1 pCAG-F和pCAG-IL12重组菌液PCR鉴定34-35
• 3.2.2 pCAG-F和pCAG-IL12重组菌液测序鉴定35
• 3.2.3 pCAG-F和pCAG-IL12重组质粒酶切鉴定35-36
• 3.3 pCAG-F和pCAG-IL12重组质粒在 293T细胞中表达产物的检测36-37
• 3.4 电穿孔技术对重组DNA疫苗pCAG-F免疫效果的影响37-40
• 3.4.1 病毒中和试验结果37-38
• 3.4.2 T淋巴细胞增殖结果38
• 3.4.3 攻毒保护效果及病毒排毒情况38-40
• 3.5 重组质粒pCAG-IL12对重组DNA疫苗pCAG-F免疫效果的影响40-43
• 3.5.1 病毒中和试验结果40-41
• 3.5.2 T淋巴细胞增殖结果41
• 3.5.3 攻毒保护效果及病毒排毒情况41-43
• 4 讨论43-46
• 4.1 关于新城疫F基因疫苗的讨论43-44
• 4.2 关于电穿孔方法增强DNA疫苗作用的探讨44-45
• 4.3 探讨IL-12对DNA疫苗免疫增强作用45-46
• 5 结论46-47
• 致谢47-48
• 参考文献48-53
• 附录53

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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本文编号：936755