NPY-PLGA缓释微球与人脂肪来源干细胞相容性的研究

发布时间：2017-10-10 12:06

  本文关键词：NPY-PLGA缓释微球与人脂肪来源干细胞相容性的研究

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【摘要】：目的：(1)从人大网膜脂肪组织中分离提取hADSCs,进行传代培养及成脂成骨化诱导,探讨其特性及作为脂肪组织工程理想种子细胞的优势；(2)通过体外成功构建NPY-PLGA微球缓释系统,检测其释放特性,以确定其具有缓释性能；(3)检测NPY-PLGA缓释微球对hADSCs毒性和凋亡的影响,分析NPY-PLGA缓释微球的细胞相容性,初步探讨其应用于脂肪组织工程研究的可行性。 材料与方法：(1) hADSCs的体外分离培养及成脂成骨化鉴定。收集手术病人大网膜的脂肪组织,经Ⅰ型胶原酶消化、过滤、离心、铺皿后进行原代培养,观察细胞生长状态。取第3代的hADSCs用于实验研究。用细胞计数法绘制hADSCs增殖曲线,计算处于对数生长期的倍增时间。用相应的定向诱导液诱导hADSCs向脂肪细胞及骨细胞方向分化,并用油红O、茜素红染色进行鉴定。(2)体外构建NPY-PLGA缓释微球,并对其性能进行检测。体外用超声乳化的方法制备NPY-PLGA缓释微球,扫描电镜观察微球形态并测量直径；检测微球产率、载药量及包封率；通过ELISA试剂盒检测NPY-PLGA体外缓释性能,检测25d。(3)检测NPY-PLGA缓释微球对hADSCs毒性和凋亡的影响。体外将NPY-PLGA缓释微球的浸渍液加入hADSCs培养液中,用MTT法检测其对hADSCs进行毒性评价；通过Annexin V-FITC凋亡试剂盒检测NPY-PLGA缓释微球影响下的hADSCs凋亡情况。 结果：(1)从手术患者大网膜脂肪组织中成功分离hADSCs,贴壁生长的hADSCs为长梭形,形态类似成纤维细胞。用细胞计数法检测细胞生长增殖能力并根据不同培养天数绘制hADSCs生长曲线,曲线呈S形,对数生长期hADSCs的倍增时间为45.90h。hADSCs经成脂、成骨定向分化诱导液分别诱导2、3周后,分别用油红O、茜素红染色呈阳性反应。(2)体外成功构建NPY-PLGA缓释微球,微球表面光滑、球体大小均匀、形态饱满；微球直径(284.30±36.50)μm；微球的产率为(20.16±1.45)%,微球样品包封率为(11.61±0.81)%,计算样品的载药量为：{(2.21±0.09)×10-3}%；通过ELISA方法检测微球缓释特性,25d内微球可缓慢释放NPY,首次释放率为10.70%,第25d累计释药率为81.80%。(3)MTT法检测NPY-PLGA缓释微球对hADSCs的毒性评价值为0级。Annexin V-FITC凋亡试剂盒检测缓释微球对hADSCs的影响,实验组与对照组比较,P0.05,差异无统计学意义。 结论：(1)利用原代细胞培养技术成功地从人大网膜脂肪组织中分离提取目的细胞,经形态学及成脂成骨化能力的鉴定证实为hADSCs。该细胞易获取、传代稳定,可作为脂肪组织工程理想的种子细胞。(2)体外超声乳化法成功构建NPY-PLGA缓释微球,缓释性能良好。(3) NPY-PLGA缓释微球与hADSCs相容性良好。
【关键词】：hADSCs 缓释微球 NPY NPY-PLGA PVA 增殖
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 目录9-11
• 本文主要的英汉缩略词名对照表11-12
• 1 前言12-15
• 2 材料与方法15-23
• 2.1 实验材料15-19
• 2.1.1 脂肪组织来源15
• 2.1.2 主要的试剂与实验用品(表2-1)15-16
• 2.1.3 主要的仪器与设备(表2-2)16-18
• 2.1.4 试剂的配置18-19
• 2.2 实验方法19-23
• 2.2.1 hADSCs的提取与培养步骤19
• 2.2.2 细胞计数法测定hADSCs的生长曲线19
• 2.2.3 hADSCs成脂诱导并行油红O染色19-20
• 2.2.4 hADSCs成骨诱导并行茜素红染色20
• 2.2.5 NPY-PLGA缓释微球的制备方法20
• 2.2.6 NPY-PLGA缓释微球的产率、载药量及包封率测定20
• 2.2.7 NPY-PLGA缓释微球的体外缓释实验20-21
• 2.2.8 MTT法检测NPY-PLGA缓释微球浸提液对hADSCs的毒性评价21
• 2.2.9 Annexin V-FITC检测NPY-PLGA浸提液对hADSCs凋亡的影响21-22
• 2.2.10 统计学及画图处理22-23
• 3 实验结果23-37
• 3.1 hADSCs的形态、增殖及成脂成骨化鉴定23-29
• 3.1.1 hADSCs的形态学观察23-25
• 3.1.2 细胞计数法检测hADSCs的生长增殖能力及绘制生长曲线25-26
• 3.1.3 hADSCs成脂诱导分化和油红O染色鉴定26-28
• 3.1.4 hADSCs成骨诱导分化和茜素红染色鉴定28-29
• 3.2 NPY-PLGA缓释微球的制备及性能检测29-33
• 3.2.1 NPY-PLGA缓释微球的制备及形态观察29
• 3.2.2 NPY-PLGA缓释微球的产率、载药量及包封率检测29-30
• 3.2.3 NPY-PLGA缓释微球的累积释放及曲线30-33
• 3.3 NPY-PLGA缓释微球对hADSCs毒性及凋亡的影响33-37
• 3.3.1 NPY-PLGA缓释微球对hADSCs的毒性评级33-35
• 3.3.2 NPY-PLGA缓释微球对hADSCs凋亡的影响35-37
• 4 讨论37-42
• 4.1 hADSCs的提取、增殖及成脂成骨化鉴定37-39
• 4.2 NPY-PLGA缓释微球的制备及性能39-40
• 4.3 NPY-PLGA缓释微球对hADSCs的毒性、凋亡影响40-42
• 5 结论42-43
• 参考文献43-48
• 综述48-59
• 参考文献54-59
• 攻读硕士学位期间主要研究成果59-60
• 致谢60

【共引文献】

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本文编号：1006264