共表达HIV-1 gag和gp145重组鸡痘病毒疫苗的构建、筛选及免疫原性研究

发布时间：2017-10-10 21:07

  本文关键词：共表达HIV-1 gag和gp145重组鸡痘病毒疫苗的构建、筛选及免疫原性研究

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【摘要】：目的：本课题研究的目的是以鸡痘病毒为疫苗载体，以HIV-1衣壳蛋白(gag)和糖蛋白(gp145)为免疫原构建HIV重组鸡痘病毒疫苗，以BALB/c小鼠为模型动物检测其免疫原性，同时开展安全性初步研究，以期筛选出一株安全有效的适用于中国人群的艾滋病治疗性疫苗。 方法：以目的基因为模板设计引物，PCR技术扩增HIV-1gag和gp145基因，进行DNA测序；然后将测序正确的两个目的基因分别插入到鸡痘病毒穿梭载体pTKET-EGFP的不同的表达框内，构建携带gag和gp145基因的重组质粒pTKET-EGFP-HIV gag-HIVgp145简称pTKET-EGFP-Hg-Hp，与鸡痘病毒FPV282E4共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，构建重组鸡痘病毒，以EGFP为筛选标记，筛选获得表达HIV-1gag、gp145和EGFP的重组鸡痘病毒，继而利用Cre/Loxp系统将报告基因敲除，获得不含报告基因的重组鸡痘病毒rFPVHg-Hp，通过RT-PCR和Western blot方法检测目的基因的表达，并分析外源基因及重组鸡痘病毒的遗传稳定性。在以上研究的基础上，，免疫实验动物BALB/c小鼠，检测其血清中HIV特异性抗体水平和GAG-specific T cells的细胞水平以及病毒的残留，分析重组鸡痘病毒rFPVHg-Hp的免疫原性和安全性。 结果：经PCR扩增和基因测序验证，成功获得HIV-1gag和HIV gp145基因，然后应用分子克隆技术成功构建重组鸡痘病毒穿梭质粒pTKET-EGFP-Hg-Hp。利用同源重组技术，通过10次噬斑筛选，PCR检测表明目的基因已整合到重组鸡痘病毒基因组中，RT-PCR、Western blot结果表明HIV-1gag和HIV gp145在感染细胞内成功表达且具有抗原性。连续传代20次，PCR、RT-PCR、Western blot均能检测到外源基因的整合、转录和表达，且未能扩增出FPV-TK基因，表明重组病毒遗传稳定性良好，而且病毒已经纯化。由ELISPOT及HIV特异性抗体IgG水平和鸡痘病毒残留检测结果初步表明，重组鸡痘病毒疫苗rFPVHg-Hp具有良好的免疫原性和安全性。 结论：成功构建了重组鸡痘病毒疫苗rFPVHg-Hp，并通过动物实验初步验证了其具备良好的免疫性和安全性，为临床前研究奠定了基础。
【关键词】：重组鸡痘病毒 HIV-1gag-gp145 IFN-γ IgG
【学位授予单位】：长春中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要5-6
• ABSTRACT6-8
• 英文缩略语8-10
• 前言10-13
• 文献综述13-21
• 1 HIV 疫苗的研究进展13-20
• 1.1 以诱导广谱中和单克隆抗体为核心的疫苗14-17
• 1.2 以诱导 CTL 反应为核心的疫苗17-19
• 1.3 HIV 疫苗研发的主要障碍和挑战19
• 1.4 相关措施19-20
• 2 总结与展望20-21
• 第一章 目的基因克隆和重组鸡痘病毒穿梭质粒构建21-30
• 1 材料与方法21-24
• 2 结果24-29
• 3 小结29-30
• 第二章 表达 HIV-1 主要结构蛋白重组鸡痘病毒的筛选与鉴定30-43
• 1 材料与方法30-36
• 2 结果36-42
• 3 小结42-43
• 第三章 HIV-1 重组鸡痘病毒候选疫苗的免疫原性研究43-51
• 1 材料与方法43-47
• 2 结果47-50
• 3 小结50-51
• 讨论51-54
• 1 目的基因克隆和重组鸡痘病毒穿梭质粒构建51
• 2 表达 HIV-1 主要结构蛋白重组鸡痘病毒的筛选与鉴定51-52
• 3 HIV-1 重组鸡痘病毒候选疫苗的免疫原性研究52-54
• 结语54-55
• 致谢55-56
• 参考文献56-66

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 冯霞;余双庆;刘红梅;刘新蕾;王小利;周玲;曾毅;;HIV-1 B亚型gag基因密码子优化及其免疫原性的研究[J];病毒学报;2008年03期

本文编号：1008594