Tim-3对H.pylori作用的鼠源性巨噬细胞内TLR4信号通路的影响

发布时间：2017-10-11 02:18

  本文关键词：Tim-3对H.pylori作用的鼠源性巨噬细胞内TLR4信号通路的影响

  更多相关文章： H.pylori RAW264.7 Tim-3 TLR4

【摘要】：背景及目的： 机体的免疫反应在幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染过程中起着重要作用，其中巨噬细胞不仅担任着固有免疫反应的角色，而且能影响适应性免疫反应。TLR4是种模式识别受体，能识别病原相关分子模式来激活巨噬细胞，导致大量炎症因子的分泌，启动并调节机体免疫反应。Tim家族是新近发现的一类跨膜蛋白家族，Tim-3是其中重要一员，研究表明它是区别Th1和Th2细胞的标志分子，Tim-3信号通路激活后能下调Th1细胞反应。大量研究表明Tim-3在固有免疫细胞如巨噬细胞上也有表达，且能通过TLR4信号通路对巨噬细胞功能产生影响。目前H.pylori对巨噬细胞Tim-3及TLR4信号通路的影响尚未见报道，因此，本文研究了H.pylori对Tim-3过表达巨噬细胞内TLR4信号通路的影响，及Tim-3与TLR4信号通路间的关系，为后续以Tim-3为靶点防治H.pylori感染及相关疾病提供实验依据。 方法： ⑴H.pylori对巨噬细胞增殖的影响 以不同MOI（感染比例）的H.pylori悉尼菌株1（HpSS1）作用于小鼠巨噬细胞，实验分组如下： 对照组：未加细菌作用 A组：细菌与细胞MOI值为25 B组：细菌与细胞MOI值为50 C组：细菌与细胞MOI值为100 D组：细菌与细胞MOI值为200 E组：细菌与细胞MOI值为400 F组：细菌与细胞MOI值为800分别培养3、6、12、24、48小时检测细胞增殖情况。 ⑵H.pylori对巨噬细胞Tim-3、TLR4、MyD88表达的影响以不同MOI的HpSS1作用小鼠巨噬细胞，实验分组如下：对照组：未加细菌组 A组：细菌和细胞MOI值为25 B组：细菌和细胞MOI值为50 C组：细菌和细胞MOI值为100 D组：细菌和细胞MOI值为200 细菌与细胞培养12小时后收集细胞。 ⑶Tim-3重组真核表达质粒的构建、鉴定 ①分离小鼠脾脏单个核细胞，设计针对Tim-3基因的特异性引物并扩增目的基因。 ②将Tim-3扩增产物插入到pLVX-IRES-ZsGreen1载体，构建重组质粒。扩增、提取重组质粒，并采用酶切和测序鉴定。 ⑷Tim-3重组真核表达质粒的真核表达 采用阳脂质体转染技术将pLVX-IRES-ZsGreen-Tim-3转入小鼠巨噬细胞，观察有无荧光及荧光强度，并收集细胞检测Tim-3mRNA及蛋白表达。 ⑸H.pylori作用对Tim-3过表达巨噬细胞Tim-3和TLR4信号通路及炎性细胞因子分泌的影响 ①Tim-3基因转染 ②实验分组 以HpSS1（MOI=100）作用小鼠巨噬细胞，实验分组如下： 对照组1：细胞+转染试剂 对照组2：细胞+转染试剂+Tim-3质粒 对照组3：细胞+转染试剂+空质粒 实验组1：细胞+转染试剂+H.pylori 实验组2：细胞+转染试剂+Tim-3质粒+H.pylori 实验组3：细胞+转染试剂+空质粒+H.pyloriH.pylori作用12小时后收集细胞和培养上清。 ⑹检测方法： ①采用MTT法检测H.pylori对巨噬细胞增殖的影响 ②采用RT-PCR的方法检测各组细胞内Tim-3、TLR4、MyD88mRNA的表达 ③采用Western Blot的方法检测各组细胞内Tim-3、TLR4、MyD88和pNF-κB p65的表达 ④采用ELISA法检测细胞上清液细胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ和IL-10。 研究结果： ⑴H.pylori对巨噬细胞增殖的影响 H.pylori作用3小时和24小时各组间细胞增殖率无统计学差异，6小时、12小时和48小时各组间有显著的统计学差异（P值均＜0.01）。6小时各组细胞增殖率随着MOI值的升高而升高，其中D、E和F组显著高于对照组（P＜0.05，P＜0.01）,E和F组均显著高于A组（P＜0.05，P＜0.01），另外，F组显著高于B、C和D组（P≤0.01）。12小时各组细胞增殖率随着MOI值的升高而升高，C、D、E和F组均显著高于对照组和A组（P＜0.05，P＜0.01），D、E和F组均显著高于B组（P＜0.01），此外，F组显著高于C和D组（P＜0.05，P＜0.01）。48小时各组细胞增殖率随着MOI值的升高而逐渐降低，，B、C、D、E和F组均显著低于对照组（P＜0.05，P＜0.01），其中C、D、E和F各组均显著低于A和B组（P＜0.05，P＜0.01），此外，D、E和F组均显著低于C组（P＜0.05，P＜0.01），E和F组均显著低于D组（P＜0.05，P＜0.01）。 ⑵H.pylori对巨噬细胞Tim-3、TLR4、MyD88mRNA表达的影响 H.pylori作用小鼠巨噬细胞12小时后显著上调Tim-3、TLR4和MyD88mRNA的表达（P＜0.01），Tim-3、TLR4和MyD88mRNA的表达在一定范围内随H.pylori浓度升高而升高（A组至C组），各实验组Tim-3mRNA表达均显著高于对照组（P＜0.01），各实验组间无显著差异（P＞0.05）；各实验组TLR4mRNA表达均显著高于对照组（P＜0.05，P＜0.01），C组显著高于A和B组(P＜0.01)，D组显著高于A和B组(P＜0.01，P＜0.05)， A与B组，C与D组间无显著差异(P＞0.05)，； B、C和D组MyD88mRNA表达均显著高于对照组(P＜0.01，P＜0.05)， C和D组均显著高于A和B组(P＜0.01，P＜0.05)， A组与对照组，B与A组， C与D组间无显著差异(P＞0.05)。 ⑶Tim-3重组真核表达质粒的构建及鉴定 成功构建pLVX-IRES-ZsGreen-Tim-3重组表达质粒，酶切后电泳显示两条带，其分子量大小与预期相一致。测序分析显示插入片段与PubMed基因文库(GenBank Accession: AF450241.1)中的Tim-3基因序列相似性为100%。 ⑷Tim-3重组真核表达质粒的表达 Tim-3重组质粒转染小鼠巨噬细胞后，在荧光显微镜下可见绿色荧光，细胞内Tim-3mRNA和蛋白表达显著高于未转染组(P0.05)，提示转染成功。 ⑸H.pylori作用对Tim-3过表达小鼠巨噬细胞Tim-3表达影响 无论有无转染Tim-3质粒，经H.pylori作用后小鼠巨噬细胞Tim-3mRNA和蛋白表达均显著高于对照组（P＜0.01，P＜0.05），在对照组中，转染了Tim-3质粒的小鼠巨噬细胞Tim-3mRNA表达显著高于未转染组和转染空质粒组（P＜0.01），在H.pylori作用组中，转染了Tim-3质粒的小鼠巨噬细胞Tim-3mRNA和蛋白表达显著高于未转染组和转染空质粒组（P＜0.01），无论有无H.pylori作用，未转染组和空质粒组之间无显著差异（P＞0.05）。 ⑹H.pylori作用对Tim-3过表达巨噬细胞内TLR4信号通路的影响 ①各组TLR4表达的变化 在未转染组和空质粒转染组中，H.pylori作用后小鼠巨噬细胞TLR4mRNA和蛋白表达均显著高于对照组（P＜0.01，P＜0.05），在Tim-3转染组中，H.pylori作用后小鼠巨噬细胞TLR4mRNA表达显著高于对照组（P＜0.01），在对照组中，未转染组、Tim-3转染组和空质粒转染组小鼠巨噬细胞TLR4mRNA和蛋白表达均无明显差异（P＞0.05）；在H.pylori作用组中，Tim-3转染小鼠巨噬细胞TLR4mRNA表达明显低于未转染组和空质粒转染组（P＜0.01），未转染组和空质粒转染组无显著差异（P＞0.05）。 ②各组MyD88表达的变化 在未转染组和空质粒转染组中， H.pylori作用后小鼠巨噬细胞MyD88mRNA和蛋白表达均显著高于对照组（P＜0.01，P＜0.05），在Tim-3转染组中，H.pylori作用后小鼠巨噬细胞MyD88mRNA表达显著高于对照组（P＜0.01），在对照组中，未转染组、Tim-3转染组和空质粒转染组小鼠巨噬细胞MyD88mRNA和蛋白表达均无明显差异（P＞0.05）；在H.pylori作用组中， Tim-3转染小鼠巨噬细胞MyD88mRNA表达明显低于未转染组和空质粒转染组（P＜0.05），未转染组和空质粒转染组无显著差异（P＞0.05）。 ③各组pNF-κB p65表达的变化 在对照组中，无论Tim-3质粒转染与否，小鼠巨噬细胞pNF-κB p65蛋白表达无统计学差异（P＞0.05），在H.pylori作用组，转染Tim-3质粒的小鼠巨噬细胞pNF-κB p65蛋白表达低于对照组和空质粒转染组，但无统计学差异（P＞0.05），未转染组和空质粒转染组加H.pylori后pNF-κB p65蛋白表达均显著高于对照组（P＜0.05）；转染Tim-3质粒的小鼠巨噬细胞pNF-κB p65蛋白表达在对照组和H.pylori作用组间无显著差异（P＞0.05）。 ⑺H.pylori作用对Tim-3过表达小鼠巨噬细胞炎症细胞因子分泌的影响 ①各组TNF-α含量的变化 在H.pylori作用组中，Tim-3转染组巨噬细胞分泌TNF-α明显低于未转染组和空质粒转染组（P＜0.01），在对照组中，Tim-3转染对巨噬细胞分泌TNF-α无明显影响（P＞0.05），在未转染组和空质粒转染组中，H.pylori作用组巨噬细胞分泌的TNF-α明显高于对照组（P＜0.01），在Tim-3转染组中，H.pylori作用与否对巨噬细胞分泌TNF-α无影响（P＞0.05），无论有无H.pylori作用，未转染组和空质粒转染组巨噬细胞分泌TNF-α无明显差异（P＞0.05）。 ②各组IL-6含量的变化 在H.pylori作用组中，Tim-3转染组巨噬细胞分泌IL-6明显低于未转染组和空质粒转染组（P＜0.01），在对照组中，Tim-3转染对巨噬细胞分泌IL-6无明显影响（P＞0.05），在未转染组和空质粒转染组中，H.pylori作用组巨噬细胞分泌的IL-6明显高于对照组（P＜0.01），在Tim-3转染组中，H.pylori作用与否对巨噬细胞分泌IL-6无影响（P＞0.05），无论有无H.pylori作用，未转染组和空质粒转染组巨噬细胞分泌IL-6无明显差异（P＞0.05）。 ③对IFN-γ的影响 在H.pylori作用组中，Tim-3转染组巨噬细胞分泌IFN-γ明显低于未转染组和空质粒转染组（P＜0.01，P＜0.05），在对照组中，Tim-3转染对巨噬细胞分泌IFN-γ无明显影响（P＞0.05），在未转染组和空质粒转染组中，H.pylori作用组巨噬细胞分泌的IFN-γ明显高于对照组（P＜0.01，P＜0.05），在Tim-3转染组中，H.pylori作用与否对巨噬细胞分泌IFN-γ无明显影响（P＞0.05），无论有无H.pylori作用，未转染组和空质粒转染组巨噬细胞分泌IFN-γ无明显差异（P＞0.05）。 ④对IL-10的影响 在H.pylori作用组中，Tim-3转染组巨噬细胞分泌IL-10明显低于未转染组和空质粒转染组（P＜0.01，0.05），在对照组中，Tim-3转染对巨噬细胞分泌IL-10无明显影响（P＞0.05），无论转染Tim-3与否，H.pylori作用组巨噬细胞分泌的IL-10明显低于对照组（P＜0.01，P＜0.05），无论有无H.pylori作用，未转染组和空质粒转染组巨噬细胞分泌IL-10无明显差异（P＞0.05）。结论： 1.H.pylori标准菌株SS1促进鼠源性巨噬细胞RAW264.7增殖，且具有H.pylori浓度依赖性。 2.鼠源性巨噬细胞RAW264.7组成性表达TLR4及Tim-3，H.pylori作用能上调TLR4信号通路及Tim-3表达，促进促炎细胞因子分泌，抑制抑炎细胞因子分泌，且具有H.pylori浓度依赖性。 3.鼠源性巨噬细胞RAW264.7过表达Tim-3后对TLR4信号通路及炎性细胞因子分泌无明显影响，但在H.pylori作用情况下Tim-3过表达能下调TLR4信号通路及炎性细胞因子分泌。
【关键词】：H.pylori RAW264.7 Tim-3 TLR4
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-21
• 第1章 引言21-25
• 第2章 材料与方法25-46
• 2.1 材料25-32
• 2.1.1 细胞株25
• 2.1.2 细菌25
• 2.1.3 实验动物25
• 2.1.4 质粒25
• 2.1.5 主要试剂25-27
• 2.1.6 主要仪器27-28
• 2.1.7 主要溶液配置28-32
• 2.2 方法32-45
• 2.2.1 细菌培养32
• 2.2.2 MTT 法检测 H.pylori 作用小鼠巨噬细胞增值率32-33
• 2.2.3 RT-PCR 检测 H.pylori 作用小鼠巨噬细胞内 Tim-3、TLR4 和MyD88 mRNA 表达33-37
• 2.2.4 Tim-3 真核表达质粒的构建及鉴定37-40
• 2.2.5 H.pylori 作用对 Tim-3 过表达小鼠巨噬细胞内 Tim-3、TLR4、MyD88 及 pNF-κB p65 表达的影响40-45
• 2.3 统计学处理45-46
• 第3章 结果46-61
• 3.1 H.pylori 作用对小鼠巨噬细胞增殖的影响46-48
• 3.2 H.pylori 作用对小鼠巨噬细胞内 Tim-3、TLR4 和 MyD88 mRNA 表达的影响48-49
• 3.3 Tim-3 真核表达质粒的构建和鉴定49-54
• 3.3.1 重组质粒的鉴定49-53
• 3.3.2 重组 Tim-3 真核质粒在小鼠巨噬细胞内的表达53-54
• 3.4 H.pylori 作用对 Tim-3 过表达小鼠巨噬细胞内 Tim-3、TLR4、MyD88 和pNF-κB p65 表达的影响54-58
• 3.4.1 H.pylori 作用对 Tim-3 过表达小鼠巨噬细胞内 Tim-3 表达的影响54
• 3.4.2 H.pylori 作用对 Tim-3 过表达小鼠巨噬细胞内 TLR4 表达的影响54-55
• 3.4.3 H.pylori 作用对 Tim-3 过表达小鼠巨噬细胞内 MyD88 表达的影响55-56
• 3.4.4 H.pylori 作用对 Tim-3 过表达小鼠巨噬细胞内 pNF-κB p65 表达的影响56-58
• 3.5 H.pylori 作用对 Tim-3 过表达小鼠巨噬细胞分泌炎性细胞因子的影响58-61
• 3.5.1 对 TNF-α的影响58
• 3.5.2 对 IL-6 的影响58-59
• 3.5.3 对 IFN-γ的影响59
• 3.5.4 对 IL-10 的影响59-61
• 第4章 讨论61-66
• 4.1 H.pylori 作用对巨噬细胞增殖的影响61
• 4.2 H.pylori 作用对巨噬细胞 TLRs 信号通路及炎性细胞因子分泌的影响61-63
• 4.3 幽门螺杆菌作用对 Tim-3 过表达巨噬细胞 TLR4 信号通路及炎性细胞因子分泌的影响63-66
• 第5章 实验结论66-67
• 致谢67-68
• 参考文献68-81
• 综述81-87
• 参考文献86-87

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