小鼠胚胎定向造血发育的表面标志研究

发布时间：2017-10-11 11:46

  本文关键词：小鼠胚胎定向造血发育的表面标志研究

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【摘要】：作为小鼠定向造血（definitive hematopoiesis）的起始，造血干细胞（hemato-poietic stem cells，HSC）的产生在胚胎发育时期一直广为关注。Medvinsky等人证实第一个HSC产生于胚胎期10.5天（E10.5）小鼠胚内的主动脉-性腺-中肾区（aorta-gonad-mesonephros region，，AGM区）。与此同时，HSC也被发现存在于E10.5的胚胎的头部、脐动脉与卵黄动脉。至E11.0-E11.5时，HSC也在血管丰富的卵黄囊（yolk sac，YS）、胎盘（placenta，PL）和胎肝(fetal liver，FL)中出现，E12.0后FL成为HSC的主要扩增位点。E17.0时HSC开始转移至骨髓（bone marrow，BM）并大量增殖。可见HSC的发育在胚胎的多个位点进行，且自我更新活跃。 探索HSC起源的精确位点一直以来都是其发育学研究的难点之一，这是由于在第一个功能型HSC被发现的同时，胚胎循环系统已经建立，因而无法得知HSC是否产生于单一且独立的原发位点。而且，至今尚未发现有任何单一标志能特异性富集胚胎期的HSC。这也使寻找其精确的原发位点变得异常困难。 本研究的第一部分，主要考察了Flk-1分子在胚胎期10.5天（E10.5）的AGM区不同类型造血前体细胞的表达情况。流式细胞学分析发现低于10%的Flk-1~+细胞与CD41、CD45/Ter119有共表达。继而分选出CD31~+CD45-Ter119-Flk-1~+CD41~+（R1，代表不成熟的造血前体细胞）和CD31~+CD45-Ter119-Flk-1~+CD41-（R2，代表内皮细胞）两群细胞，利用造血集落培养和OP9共培养体系分别考察其体外的髓系与淋系潜能。结果表明：仅R1组细胞能在造血集落培养体系中形成典型的造血集落；但与OP9共培养7-9天后，两组细胞均能产生丰富的造血前体细胞（CD45~+c-Kit~+）、髓系细胞（Gr-1~+/Mac-1~+）、红细胞（Ter119~+）和B淋巴细胞（CD19~+）。上述结果表明：E10.5的小鼠胚胎AGM区，Flk-1仍然在幼稚的造血前体细胞以及更早期的生血内皮细胞表达。但是，此时的造血干细胞前体和造血干细胞是否表达Flk-1仍需通过体内功能实验明确。 本研究的第二部分，主要考察了CD47分子在E10.0-E12.5相关造血位点不同类型造血细胞的表达情况。流式分析显示：E10.5AGM/YS/循环血、E11.5AGM/YS/PL和E12.5循环血中的活细胞中分别有1.0%/13.3%/2.1%、1.4%/13.4%/13.6%和0.9%的细胞表达CD47。流式分选出E10.0AGM/卵黄囊/循环血中的CD47~+与CD47-两群细胞后，应用体外的CFU-C实验检测两群细胞的体外髓系潜能，培养7-9天后发现E10.0AGM/YS/循环血中仅CD47~+细胞群能产生典型的造血集落（CFU-C）。说明在CFU-C培养体系中，仅CD47~+群中含有髓系祖细胞。随后我们利用流式细胞术分选出E10.5AGM区内的c-Kit~+CD47~+（R1）与c-Kit~+CD47-（R2）两群细胞，利用OP9共培养体系检测上述两群细胞的体外造血潜能，培养7-9天发现两群均能在OP9共培养体系下形成一定比例的CD45~+c-Kit~+细胞（造血细胞）、Ter119~+细胞（红细胞）、Gr-1~+/Mac-1~+细胞（髓系祖细胞）、B220~+细胞（B淋巴细胞或前体），这表明：在OP9共培养体系下，E10.5AGM区内CD47~+细胞与CD47-细胞均具有一定的造血潜能。为明确HSC表面是否表达CD47，我们同样利用流式细胞术将E11.5AGM区、卵黄囊和胎盘的细胞分选为c-Kit~+CD47~+（R1）与c-Kit~+CD47-（R2）两群细胞。随后的移植实验结果显示仅R1群能产生造血重建。这表明E11.5AGM、卵黄囊和胎盘中的HSC均表达CD47，从而进一步证实CD47能富集此时AGM区、卵黄囊和胎盘中所有的HSC。有趣的是，当我们将E12.5循环血中的R1群分选至c-Kit~+CD47high与c-Kit~+CD47low群之后，造血重建却全部发生在c-Kit~+CD47low群中，表明此时循环血中所有的HSC集中在CD47low群。
【关键词】：造血前体细胞 造血干细胞 造血发育 小鼠胚胎 Flk-1 CD47
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 目录4-5
• 缩略词5-7
• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 前言12-15
• 第一部分 Flk-1 在小鼠胚胎造血前体细胞中的表达15-24
• 实验流程15-16
• 材料与方法16-18
• 结果18-23
• 小结23-24
• 第二部分 CD47 在小鼠胚胎造血细胞中的表达24-42
• 实验流程24-25
• 材料与方法25-28
• 结果28-41
• 小结41-42
• 讨论42-48
• 结论48-49
• 参考文献49-58
• 附录58-59
• 致谢59-60
• 综述60-78
• 参考文献67-78

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 王建;卢光t;;血液血管干细胞的研究进展[J];国外医学.输血及血液学分册;2005年01期

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 王跃嗣;人nthESC向HSC诱导分化和胚胎造血标志物表达研究[D];西北农林科技大学;2005年

2 郭虹;胎儿多种组织间充质干细胞生物学特征及胎儿骨髓血液血管干细胞特性的研究[D];中国协和医科大学;2003年

本文编号：1012354