结核分枝杆菌HtpG蛋白的表达纯化、结晶及其与CrRNA的相互作用

发布时间：2017-10-13 00:16

  本文关键词：结核分枝杆菌HtpG蛋白的表达纯化、结晶及其与CrRNA的相互作用

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【摘要】：目前由世界卫生组织报道，在2010年，全世界900万人患结核病，140万人死亡，而这其中95%发生在发展中国家。我国每年新发结核病人数占全球总数的17%，位居世界第二。因此,对于结核病的病原体——结核分枝杆菌——的致病机理以及免疫机制展开深入研究显得尤为重要。 HtpG是原核生物重要的分子伴侣，在抵御外界压力的过程中有着重要的作用。它是hsp90的原核同源物。Hsp90使生物有效抵御环境压力。其独特的性质使它成为治疗的良好分子靶点。对于HtpG及其在结核分枝杆菌中的深入研究可以对结核病的治疗以及防治提供新的思路。 CRISPR系统是结核分枝杆菌中的一种适应性免疫系统，对菌体消灭外来质粒和噬菌体以及抵抗和阻止质粒及噬菌体的繁殖有着不可忽视的作用。近年来有报道称，HtpG对大肠杆菌中的CRISPR/Cas（CRISPR-associated）系统是必需的。如果HtpG缺失，CRISPR系统将丢失在溶原作用中抵御噬菌体的感染的自杀行动并且丢失了免疫能力。然而，，当HtpG被回补后，CRISPR/Cas系统丢失的活性得到了恢复。 依据现有的一些研究成果，预测结核分枝杆菌中同样存在CRISPR系统，并且HtpG对CRISPR系统的活性有作用。结核分枝杆菌中Rv2299c基因对应的蛋白即HtpG。本文据此，在生物信息学分析的基础上，提取结核分枝杆菌H37Rv株的基因组作为模板，对结核分枝杆菌H37Rv标准株中的Rv2299c基因进行克隆以及融合表达，构建了原核重组表达质粒pET28a-Rv2299c，并且在原核中高效表达。对纯化后的融合蛋白进行了结晶实验，初筛长出来了棒状晶体。同时，将Rv2299c连接到了穿梭载体pMV261H中，并转入了耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis），采用抗his标签的抗体检测重组子已正确表达HtpG蛋白。 在CRISPI数据库得到结核分枝杆菌H37Rv的CRISPR的预测序列，选取一段CRISPR的序列，在RNA fold web server中预测其RNA二级结构。通过合成模板，PCR扩增后在体外转录成RNA。RNA经过纯化后将其进行去磷酸化处理，使用T4多聚核苷酸激酶在5’端加上γ-~(32)P ATP标记后，与HtpG蛋白进行孵育。经非变性胶检测，放射性显影确定了HtpG蛋白和所选取的CRISPR的序列有相互结合的作用。
【关键词】：结核分枝杆菌 高温蛋白G 定期间隔开的短回文重序列丛集 CrRNA
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 目录5-9
• 摘要9-11
• Abstract11-13
• 英文缩写表13-15
• 1 文献综述15-25
• 1.1 结核病15-16
• 1.1.1 世界结核病疫情15
• 1.1.2 我国结核病疫情15
• 1.1.3 结核病简介15-16
• 1.1.4 结核病分类16
• 1.1.5 结核病历史16
• 1.2 结核分枝杆菌16-18
• 1.2.1 结核分枝杆菌的形态17
• 1.2.2 结核分枝杆菌细胞壁成分17
• 1.2.3 结核分枝杆菌的抗酸染色17
• 1.2.4 结核分枝杆菌的生长特性17-18
• 1.2.5 结核分枝杆菌的生化特点18
• 1.2.6 结核分枝杆菌的抵抗力18
• 1.2.7 结核分枝杆菌的对抗药物18
• 1.3 热休克蛋白18-21
• 1.3.1 热休克蛋白的简介18-19
• 1.3.2 热休克蛋白 90 的结构19-20
• 1.3.3 热休克蛋白 90 的功能20-21
• 1.4 CRISPR/Cas 系统21-24
• 1.4.1 CRISPR/Cas 系统的简介21-22
• 1.4.2 CRISPR/Cas 系统的结构22-23
• 1.4.3 CRISPR/Cas 系统的功能23
• 1.4.4 CRISPR/Cas 系统的作用过程23-24
• 1.5 本研究的目的和意义24-25
• 2 结核分枝杆菌 HtpG 蛋白的表达和纯化25-48
• 2.1 实验材料25-28
• 2.1.1 质粒25
• 2.1.2 菌株25
• 2.1.3 培养基25
• 2.1.4 主要试剂25-26
• 2.1.5 常用缓冲液及其它溶液26-27
• 2.1.6 主要仪器27-28
• 2.2 实验方法28-38
• 2.2.1 Rv2299c 基因编码的蛋白质生物信息学分析28
• 2.2.2 Rv2299c 基因的克隆28-30
• 2.2.3 重组质粒 pET28a- Rv2299c 和 pMV261H- Rv2299c 的构建和鉴定30-33
• 2.2.4 重组质粒 pET28a-Rv2299c 在大肠杆菌中的诱导表达与纯化33-34
• 2.2.5 重组质粒 pMV261H-Rv2299c 在耻垢分枝杆菌的转化与鉴定34-35
• 2.2.6 重组质粒 pMV261H-Rv2299c 在耻垢分枝杆菌中的诱导表达及 WB 鉴定35-37
• 2.2.7 His-HtpG 融合蛋白的结晶及初步衍射37-38
• 2.3 结果和分析38-46
• 2.3.1 Rv2299c 基因编码的蛋白质生物信息学分析38
• 2.3.2 结核分枝杆菌 H37Rv 基因组提取38-39
• 2.3.3 目的基因 Rv2299c 的 PCR 扩增39
• 2.3.4 pET28a-Rv2299c 和 pMV261H- Rv2299c 重组载体初步验证39-40
• 2.3.5 pET28a-Rv2299c 和 pMV261H-Rv2299c 重组载体测序验证40-41
• 2.3.6 His- HtpG 融合蛋白的表达和纯化41-43
• 2.3.7 蛋白质浓度的测定43-44
• 2.3.8 重组质粒 pMV261H-Rv2299c 在耻垢分枝杆菌中的 PCR 鉴定44-45
• 2.3.9 重组质粒 pMV261H-Rv2299c 在耻垢分枝杆菌中的诱导表达的 WB 鉴定45
• 2.3.10 His-HtpG 融合蛋白结晶及晶体的初步衍射分析45-46
• 2.4 讨论46-48
• 3 CrRNA 的制备48-58
• 3.1 实验材料48-49
• 3.1.1 主要试剂48
• 3.1.2 常用溶液48-49
• 3.1.3 主要仪器49
• 3.2 实验方法49-53
• 3.2.1 目的基因的二级结构预测49
• 3.2.2 模板的制备49-50
• 3.2.3 引物的合成50
• 3.2.4 目的基因的扩增和纯化50-51
• 3.2.5 目的基因的转录51-52
• 3.2.6 CrRNA 的 PAGE 检测52
• 3.2.7 CrRNA 的纯化52-53
• 3.3 结果和分析53-56
• 3.3.1 目的基因的二级结构预测53-54
• 3.3.2 目的基因的 PCR 扩增54-55
• 3.3.3 目的基因的转录55
• 3.3.4 目的基因的纯化55-56
• 3.4 讨论56-58
• 3.4.1 模板的制备56
• 3.4.2 引物的合成56-57
• 3.4.3 目的基因的 PCR 扩增57
• 3.4.4 目的基因的转录和纯化57-58
• 4 HtpG 蛋白与 CrRNA 的结合作用58-63
• 4.1 实验材料58-59
• 4.1.1 主要试剂58
• 4.1.2 常用缓冲液及其它溶液58-59
• 4.1.3 主要仪器59
• 4.2 实验方法59-61
• 4.2.1 CrRNA 的去磷酸化处理59
• 4.2.2 CrRNA 的同位素标记59-60
• 4.2.3 标记后的 RNA 与蛋白的孵育60
• 4.2.4 非变性的聚丙烯凝胶电泳检测60-61
• 4.2.5 同位素放射自显影61
• 4.3 结果和分析61-62
• 4.4 讨论62-63
• 5 结论与展望63-64
• 参考文献64-72
• 致谢72

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 王菲;罗恩杰;;CRISPR及其在原核生物防御系统中的作用[J];热带医学杂志;2008年10期

2 王黎霞;成诗明;陈明亭;赵雁林;张慧;姜世闻;何广学;吕青;杜昕;陈伟;刘小秋;阮云洲;王胜芬;夏aa;于兰;李峻;李雪;;2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告[J];中国防痨杂志;2012年08期

本文编号：1021753