21三体综合征诱导多能干细胞系的建立及诱导神经分化的研究

发布时间：2017-10-13 13:17

  本文关键词：21三体综合征诱导多能干细胞系的建立及诱导神经分化的研究

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【摘要】：【研究背景】 21三体综合征又称为唐氏综合征（Down’s syndrome,DS）或先天愚型，是常见的由常染色体变异导致中至重度智力障碍等多种临床表现的疾病。在我国该病的发生率占出生人数的1/600～1/800，占受孕人数的1/150。由于该病的基因表达的复杂性、表型的多样性以及个体间的差异，使该疾病的发病机制一直未能被完全解释。诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells or iPSCs）是一类将特定转录因子导入分化成熟的体细胞后使其发生重编程而形成的具有多能性的干细胞。特异疾病的iPSCs研究很大程度地保留了成体细胞基因组的遗传信息，并且iPSCs能通过细胞分裂维持细胞数量，为疾病的研究提供了真实的体外细胞模型并解决了疾病研究的细胞供源问题。iPSCs同时具有向各类型组织细胞分化的潜能，其分化为特定的靶细胞可为特异疾病发病机制的研究提供标本和完整的发育模型，为研究DS等染色体疾病提供了一种新的有利的工具。 【目的】 建立羊水细胞及皮肤成纤维细胞来源的21三体诱导多能干细胞系（Trisomy21human amniotic fluid induced pluripotent stem cells,T21hAF-iPSCs and Trisomy21human dermal fibroblasts induced pluripotent stem cells,T21hDF-iPSCs），比较两种细胞来源的建系效率，为疾病的机制研究提供理想细胞模型，同时研究21三体综合征诱导多能干细胞从全能性细胞向神经细胞诱导分化的过程。 【方法】 1.本研究利用慢病毒介导4种转录因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）分别诱导建立了羊水细胞及患儿皮肤成纤维细胞来源的21三体综合征诱导多能干细胞系，并通过碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色、qPCR检测基因表达等方法鉴定其多能性。 2.利用EB悬浮培养法对细胞进行体外分化，用PCR检测各胚层特有基因的表达情况，并各取1×107个T21-iPSCs注射到SCID小鼠皮下，，6周后得到畸胎瘤，行HE染色，观察iPSCs在体内的分化情况。 3.T21-iPSCs每传10代重复一次核型分析，检测T21-iPSCs遗传性状的稳定情况。 4.1×105个感染后的两种来源细胞接种在饲养层上，比较出现克隆的时间长短；在25天进行碱性磷酸酶染色，得到出现阳性克隆的效率并进行统计学分析。 5.对T21-iPSCs及正常人iPSCs利用EB诱导法进行体外神经干细胞的诱导分化，进行免疫荧光染色并比较阳性率；获得神经干细胞后添加特定细胞因子进一步诱导其向神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞分化，进行免疫荧光染色并通过特异蛋白阳性表达来比较分化效率。 【结果】 1.分别建立了羊水细胞及皮肤成纤维细胞来源的21三体综合征的诱导多能干细胞系，通过免疫荧光染色发现胚胎干细胞特异性表面抗原Oct4、Nanog、TRA-1-60、SSEA-4染色阳性；qPCR检测的T21-iPSCs内源性多能性基因Nanog、Oct4已被激活，与正常人ES细胞表达水平相似；在持续传代过程中细胞形态学表现稳定，核型检测发现T21-iPSCs在传代过程中能维持异常核型；畸胎瘤实验发现T21-iPSCs形成的畸胎瘤可分化为三个胚层。 2.约1×105个感染后的两种类型细胞接种在饲养层上，羊水细胞在5-7天时出现了胚胎干细胞样的克隆，而皮肤成纤维细胞在13-15天出现克隆。在25天进行碱性磷酸酶染色，羊水细胞来源的得到285个阳性克隆，效率为0.285%。皮肤成纤维细胞得到27个克隆，效率为0.027%。经X2检验P0.05，诱导羊水细胞与皮肤成纤维细胞形成多能性干细胞的效率差异有统计学意义。 3.对T21-iPSCs进行神经诱导分化，T21-iPSCs与正常人iPSCs体外分化神经干细胞免疫荧光结果显示Nestin、Pax6呈阳性，比较诱导效率无显著差异。继续将神经干细胞诱导分化为三种神经细胞系，细胞免疫荧光检测结果显示三种神经细胞系的表面标志Tuj1、GFAP和O4的表达为阳性。在分化成神经元和神经胶质细胞的效率方面，T21-iPSCs与对照组相比无显著差异。 【结论】 1.21三体综合征疾病的诱导多能干细胞系在体外长期传代中能维持异常核型及干细胞多能性，可作为DS研究的细胞模型； 2.利用羊水细胞建立T21-iPSCs效率高于皮肤成纤维细胞，羊水细胞可能是制备T21-iPSCs的理想细胞类型； 3.T21-iPSCs在神经分化过程中，向神经干细胞、神经元及神经胶质细胞分化的效率与正常的iPSCs相比无显著差异。
【关键词】：21三体综合征 羊水细胞 皮肤成纤维细胞 诱导多能干细胞 神经分化
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-9
• 英文缩写词汇表9-10
• 1.前言10-12
• 2.材料与方法12-26
• 2.1 实验材料12-15
• 2.1.1 细胞来源12
• 2.1.2 主要仪器与设备12-13
• 2.1.3 主要试剂13-14
• 2.1.4 常用试剂配制14-15
• 2.2 实验方法15-26
• 2.2.1 目的细胞的培养15-16
• 2.2.2 饲养层的制备16-17
• 2.2.3 慢病毒转染系统17-18
• 2.2.4 iPSCs 的培养18-19
• 2.2.5 核型分析19-20
• 2.2.6 21 三体综合征 iPS 细胞（T21-iPSCs）多能性的鉴定20-25
• 2.2.7 神经分化25
• 2.2.8 统计分析25-26
• 3.结果与分析26-39
• 3.1 21 三体综合征羊水细胞及皮肤成纤维细胞的培养26
• 3.2 慢病毒诱导 21 三体综合征羊水细胞、皮肤成纤维细胞产生 iPSCs26-29
• 3.2.1 T21-iPSCs 细胞形态与 ES 细胞相似27-28
• 3.2.2 诱导效率的比较28-29
• 3.3 T21-iPSCs 核型分析29-30
• 3.4 T21-iPSCs 多能性的鉴定30-35
• 3.4.1 T21-iPSCs 碱性磷酸酶染色30-31
• 3.4.2 T21-iPSCs 免疫荧光染色31
• 3.4.3 检测 T21-iPSCs 胚胎干细胞相关基因及四种外源性基因的表达情况31-33
• 3.4.4 T21-iPSCs 体外分化能力的检测33-34
• 3.4.5 T21-iPSCs 体内分化能力的检测34-35
• 3.5 T21-iPSCs 定向诱导神经分化35-39
• 3.5.1 向神经干细胞分化35-37
• 3.5.2 神经干细胞向三种神经细胞系的分化37-39
• 4.讨论39-43
• 4.1 两种细胞来源的 21 三体综合征诱导多能干细胞系的建立39-41
• 4.2 体外诱导 T21-iPSCs 向神经系统细胞分化41-43
• 5.结论43-44
• 6.参考文献44-46
• 综述46-54
• 参考文献52-54
• 攻读学位期间取得的研究成果54-55
• 致谢55-56

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本文编号：1025044