T细胞CD59GPI对LAT脂筏内移位及跨膜信号转导的作用机制研究

发布时间：2017-10-14 19:33

  本文关键词：T细胞CD59GPI对LAT脂筏内移位及跨膜信号转导的作用机制研究

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【摘要】：目的构建T细胞活化连接蛋白(LAT)-EGFP融合蛋白真核表达载体,以及利用基因点突变技术使LAT-EGFP的棕榈酰化位点突变构建LAT-EGFP-M真核表达载体,并将两种真核表达载体转染入Jurkat细胞中稳定表达,研究CD59在T细胞信号转导过程中与LAT的相互作用,探讨CD59向胞内传递信号的机制。 方法从人T细胞白血病细胞Jurkat细胞中提取总RNA,利用RT-PCR的方法扩增LAT基因,构建LAT-EGFP真核表达载体,并利用点突变技术使LAT-EGFP近膜处的棕榈酰化位点的络氨酸替换为甘氨酸,构建棕榈酰化位点突变的LAT-EGFP-M真核表达载体：采用电转染的方法转染Jurkat细胞,双抗交联CD59后,荧光共聚焦显微镜下观察LAT分布情况的变化：用噻唑蓝(MTT)比色法检测抗体交联前各组后Jurkat细胞增殖情况差别；应用ELISA检测各组细胞上清中IL-2的变化水平；用Western blot技术检测抗体交联后LAT-EGFP和LAT-EGFP-M的磷酸化程度。 结果经限制性内切酶酶切、western blot技术及测序鉴定LAT-EGFP真核表达载体和LAT-EGFP-M构建成功；抗体交联CD59之后,LAT-EGFP-M较LAT-EGFP相比不能定位聚集于CD59所在的脂筏区域,并且转染了突变LAT-EGFP-M质粒的Jurkat细胞增增速度和IL-2分泌能力低于转染LAT-EGFP质粒的对照组。转染空载体EGFP-N3及未转染的细胞,LAT-EGFP-M的磷酸化程度远低]LAT-EGFP。 结论LAT参与CD59信号转导过程,并且二者作用位点与棕榈酰化基团有关。这为研究CD59类GPI锚固蛋白的信号转导方式奠定了基础。
【关键词】：CD59 T细胞活化连接蛋白 棕榈酰化 T淋巴细胞
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392.12
【目录】：

• 摘要2-3
• Abstract3-6
• 引言6-7
• 第1章 材料与方法7-20
• 1.1 材料7-8
• 1.1.1 主要仪器设备7
• 1.1.2 质粒、菌株与细胞株7
• 1.1.3 主要实验试剂7-8
• 1.2 方法8-20
• 1.2.1 LAT-EGFP重组质粒的构建8-15
• 1.2.1.1 PCR扩增引物的设计8
• 1.2.1.2 Jurkat细胞的培养8
• 1.2.1.3 Jurkat细胞内总RNA的提取8-9
• 1.2.1.4 目的基因的扩增9-10
• 1.2.1.5 LAT-T重组克隆载体的构建及鉴定10-12
• 1.2.1.6 LAT-EGFP重组载体的构建和鉴定12-15
• 1.2.2 Jurkat细胞的转染15-17
• 1.2.2.1 Jurkat细胞的培养15
• 1.2.2.2 Jurkat细胞的电转染15-16
• 1.2.2.3 转染细胞阳性克隆的鉴定16-17
• 1.2.3 功能检测17-19
• 1.2.3.1 Jurkat细胞固定观察LAT-EGFP,LAT-EGFP-M与CD59在细胞膜上的自然分布情况17-18
• 1.2.3.2 抗体交联CD59后激光共聚焦显微镜下观察LAT-EGFP,LAT-EGFP-M与CD59在细胞膜上的分布变化18
• 1.2.3.3 MTT比色法检测Jurkat细胞增殖活性18
• 1.2.3.4 IL-2 ELISA的检测18-19
• 1.2.3.5 Western blot法检测19
• 1.2.4 统计学分析19-20
• 第2章 实验结果20-27
• 2.1 LAT-EGFP重组真核表达载体的构建20-22
• 2.1.1 LAT基因片段的扩增20
• 2.1.2 LAT-T克隆载体的PCR及酶切鉴定20-21
• 2.1.3 PEGFP-N3-Linker的单酶切鉴定21
• 2.1.4 阳性重组质粒LAT-EGFP的PCR及酶切鉴定21-22
• 2.2 重组质粒转染Jurkat细胞及鉴定22-24
• 2.2.1 重组质粒电转染Jurkat细胞后观察荧光量表达22
• 2.2.2 LAT-EGFP融合基因在RNA水平上的表达鉴定22-23
• 2.2.3 共聚焦显微镜下观察LAT-EGFP的分布23
• 2.2.4 Western blot鉴定融合蛋白的表达23-24
• 2.3 功能检测结果24-27
• 2.3.1 转染后固定的Jurkat细胞上CD59和LAT-EGFP,LAT-EGFP-M分布情况24-25
• 2.3.2 抗体交联CD59后观察膜上分子的分布变化25
• 2.3.3 MTT检测结果25-26
• 2.3.4 IL-2 ELISA检测结果26
• 2.3.5 Western blot的结果26-27
• 第3章 讨论27-30
• 结论30-31
• 参考文献31-34
• 综述34-45
• 综述参考文献40-45
• 攻读学位期间的研究成果45-46
• 附录146-50
• 附录250-52
• 致谢52-53

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 高美华;钟丹丹;张蓓;;CD59-CD2对T细胞信号转导的作用[J];免疫学杂志;2011年09期

2 王娟;高美华;张蓓;;CD59锚定蛋白对CD3介导Jurkat细胞活化信号转导中的增强效应[J];免疫学杂志;2011年11期

3 高美华;王美娟;张蓓;解西河;王冰;;CD46 RNAi对CD59介导的T细胞信号转导的作用研究[J];免疫学杂志;2012年07期

4 王文举;李鸿钧;孙茂盛;;脂筏与T细胞信号转导[J];生命科学;2007年05期

5 聊菲;高美华;张蓓;;CD59锚定蛋白对CD55介导的T细胞信号转导的增强效应[J];细胞与分子免疫学杂志;2011年02期

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本文编号：1032785