杀伤性人工抗原提呈细胞治疗小鼠皮肤移植排斥及其对治疗鼠整体免疫功能的影响

发布时间：2017-10-15 14:01

  本文关键词：杀伤性人工抗原提呈细胞治疗小鼠皮肤移植排斥及其对治疗鼠整体免疫功能的影响

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【摘要】：选择性清除或抑制同种反应性T细胞是治疗移植排斥和自身免疫病等的理想策略之一,因为它能避免免疫抑制剂所导致的患者整体免疫功能损伤。因此,几十年来人们一直在探索各种特异性免疫疗法,杀伤性人工抗原提呈细胞(Killer artificial antigen presenting cell,KaAPC)就是其中之一。KaAPC是利用基因工程的方法使现有的抗原提呈细胞表面表达Fas配体,并通过细胞膜上的pMHC分子靶向结合抗原特异性T细胞,同时通过膜上的FasL与活化后T细胞膜上的Fas分子结合从而诱导T细胞凋亡。这种策略对同种移植排斥、自身免疫病及变态反应等的治疗都有很多成功的报道。然而,杀伤性细胞疗法同时也遭到强烈的质疑：除了生物安全性和原代DC等细胞的大规模制备困难外,更重要的是FasL在载体细胞膜上的表达水平难以均匀的控制。为了避免细胞性疗法的这些缺陷,近年来人们转而关注以非细胞性物质为载体,标记pMHC多聚体和FasL,制备靶向杀伤性制剂。这种非细胞性的KaAPC在体内的靶向杀伤效应仍少有报道。本论文利用在人体内可生物降解、有组织相容性的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球(poly-lactic-co-glycolic acid,PLGA)共吸附H-2Kb-Ig二聚体和anti-Fas单抗,制作以H-2kb分子为靶向抗原的KaAPCs,研究其治疗小鼠皮肤移植排斥的效果及其对治疗鼠整体免疫功能的影响。结果显示：KaAPCs治疗能明显延长皮肤移植物的存活期,治疗鼠的整体免疫功能如抗肿瘤能力和对第三方供体的同种反应能力等也没有明显受损。主要结果如下：1)利用双乳化剂挥发法成功制备了表面功能化的、直径4.5μm的PLGA微球。扫描电镜、Zeta电位和粒径分析显示其具有良好的表征：呈规则球形,表面完整,61.2%的微球直径在4.0-5.0μm,平均Zeta(ζ-)电位为36.3mV±6.11mV,分散性好,表面氨基基团丰富；BSA和单抗包被实验显示其有良好的蛋白负载能力：对BSA的最大负载量为54.2μg/5×106 beads;利用H-2Kb-Ig二聚体和anti-Fas单抗共包被PLGA微球,成功制备以H-2Kb分子为靶向抗原的KaAPCs,单抗染色和流式分析证实有正确表型。2)以C57BL/6鼠(H-2Kb)和BALB/c鼠(H-2Kd)为皮肤移植的供受体,在移植术后第5、7、9天经尾静脉分别注射KaAPC、anti-Fas PLGA、Blank PLGA或PBS进行分组治疗,然后：在第12天取各组脾细胞胆,CFSE标记后在体外与第三方KM鼠的脾细胞行单向混合淋巴细胞培养3天和7天,流式分析各族治疗鼠GD3+T细胞群的同种增殖能力；皮肤移植术后第3天皮下注射SP2/0骨髓瘤细胞,而后进行分组治疗,并每天测量肿瘤大小,第23天时杀鼠取肿瘤组织,称重,制冰冻切片后FITC-anti-mouse CD3单抗染色。结果显示：KaAPC治疗组皮肤移植物的中位存活时间比对照组延长4.5-7天：治疗鼠脾脏T细胞在体外对第三方小鼠脾细胞的同种增殖能力无明显降低；治疗鼠载瘤实验的成瘤时间、肿瘤生长曲线以及肿瘤组织中CD3+T淋巴细胞的浸润等与对照组无明显差异。3)以C57BL/6鼠(H-2Kb)和bml鼠(h-2kbml)为皮肤移植的供受体。两者的遗传背景只有H-2Kb抗原上三个氨基酸的差异。这种移植模型将能最大限度地凸显H-2Kb同种反应性T细胞的清除或抑制对移植排斥的影响。在皮肤移植术后第7、9、11天经尾静脉分别注射KaAPC、anti-Fas PLGA、Blank PLGA或PBS进行分组治疗,然后：在移植术后第14天取各组脾细胞,CFSE标记后,在体外与第三方BALB/c鼠的脾细胞行单向混合淋巴细胞培养3天和7天,流式分析各组治疗鼠CD3+T和CD8+T细胞群的同种反应增殖能力；皮肤移植术后第3天皮下注射B16黑色素瘤细胞,而后分组治疗,并每天测量肿瘤大小,第23天时杀鼠取肿瘤组织,称重,制冰冻切片后APC-anti-mouse CD3以及FITC-anti-mouse CD8单抗染色：在第11天选部分鼠取脾脏细胞用CFSE标记,与Yac-1淋巴瘤细胞混合培养4-5h,后用7-AAD染色死亡细胞,流式分析NK细胞的杀瘤活性；在第9、11、13天各选部分鼠取脾脏细胞,用APC-anti-CD3、FITC-Annexin V和PI做三色荧光染色,流式分析各组CD3+T细胞群中凋亡T细胞的比例及脾脏中T细胞的频率；在第9和13天各选部分鼠取眼眶周围血,经血液分析仪行血常规分析。结果显示：KaAPC治疗组皮肤移植物的中位存活时间比对照组延长24.3-27.3天；治疗鼠中,脾脏T细胞在体外对第三方小鼠脾细胞的同种增殖能力无明显降低：移植瘤的成瘤时间、肿瘤生长曲线以及肿瘤组织中CD3+T和CD8+T细胞的浸润等与对照组无明显差异；脾脏NK细胞的杀瘤能力亦无显著下降；在第三次治疗后(即第13天),脾脏T细胞群中凋亡细胞的比例显著高于对照组,T细胞频率则显著低于对照组；在第三次治疗后,外周血中性粒细胞比例较对照组显著降低,单核细胞和淋巴细胞的数量则无明显下降。4)利用双乳化剂挥发法成功制备了表面功能化的、直径为450nm以及200nm的PLGA纳米球,具有良好的表征：呈规则球形,表面完整；平均Zeta电位为36.2mV+5.00mV左右；共包被H-2Kb-Ig二聚体和anti-Fas单抗后制成两种直径的纳米级KaAPC,经PE-anti-H-2Kb单抗和FITC-anti-hamster IgG单抗免疫荧光染色分析证实其表型正确；在C57BL/6 (H-2Kb)和BALB/c鼠(H-2Kd)为供受对的皮肤移植模型中,直径为450nm的KaAPC经尾静脉三次输注治疗未见明显疗效,而直径为200nm的KaAPC经尾静脉三次输注治疗能明显延长皮肤移植物的存活时间。
【关键词】：杀伤性人工抗原提呈细胞 同种反应性T细胞 同种皮肤移植 聚乳酸-羟基乙酸
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R457.2
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 主要英文缩写词10-13
• 前言13-16
• 文献综述 杀伤性人工抗原提呈细胞的研究进展16-28
• 参考文献22-28
• 第一章 杀伤性人工抗原提呈细胞(KaAPC)的制备与表型验证28-40
• 引言28-29
• 1. 材料和试剂29-30
• 2. 方法30-34
• 3. 结果34-39
• 4. 讨论39-40
• 第二章 KaAPC治疗BALB/c鼠皮肤移植排斥及其对整体免疫功能的影响40-55
• 引言40-41
• 1. 材料和试剂41-43
• 2. 方法43-46
• 3. 结果46-53
• 4. 讨论53-55
• 第三章 KaAPC治疗bml鼠皮肤移植排斥及其对整体免疫功能的影响55-82
• 引言55-56
• 1. 材料和试剂56-58
• 2. 方法58-65
• 3. 结果65-79
• 4. 讨论79-82
• 第四章 纳米级KaAPC治疗BALB/c鼠皮肤移植排斥的初步研究82-91
• 引言82-83
• 1. 材料和试剂83
• 2. 方法83-85
• 3. 结果85-90
• 4. 讨论90-91
• 小结与展望91-93
• 参考文献93-97
• 致谢97-98
• 作者简介98

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本文编号：1037505