空肠弯曲菌cdtB和cdtC原核表达及其产物的单克隆抗体制备

发布时间：2017-10-15 21:10

  本文关键词：空肠弯曲菌cdtB和cdtC原核表达及其产物的单克隆抗体制备

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【摘要】：空肠弯曲菌是引起世界各地急性胃肠炎的主要病原菌。感染的病人除了表现出急性、自限性腹泻外,特定血清型的空肠弯曲菌能引起自身免疫疾病,如格林-巴利综合症(GBS)。空肠弯曲菌有许多致病因子如：黏附、侵袭和产毒素,细胞致死性肿胀毒素(Cytolethal distendin toxin, CDT)是一种由革兰氏阴性细菌产生的细菌外毒素,空肠弯曲菌也能产生这种毒素。CDT由三个相邻的cdtA、cdtB和cdtC编码。CDT毒素具有细胞毒性,能够损伤真核细胞的DNA,使细胞周期阻滞在G2/M期,最终使受损伤的细胞肿胀死亡。目前,对空肠弯曲菌细胞致死性肿胀毒素功能机理等研究还不够深入。本研究通过大肠杆菌表达系统表达cdtB、cdtC基因,纯化His-CdtB、His-CdtC、GST-CdtC蛋白,以His-CdtB蛋白为基础,建立检测空肠弯曲菌抗体的间接ELISA方法；同时以GST-CdtB的包涵体和GST-CdtC蛋白为免疫原；His-CdtB, His-CdtC蛋白为检测原,利用淋巴细胞杂交瘤技术,制备CdtB和CdtC的单克隆抗体,为CDT毒素功能、诊断技术等方面的研究奠定基础。 一、空肠弯曲菌细胞致死性肿胀毒素cdtB、cdtC的原核表达 根据GenBank上公布的空肠弯曲菌NCTC11168的cdtB和cdtC基因序列设计引物。扩增不含信号序列的2个基因,并与pMD-18T载体连接,酶切、测序鉴定正确后,将cdtB基因连接到表达载体pET(30a)和pGEX-6p-1,获得重组菌BL21(pET-cdtB)和BL21(pGEX-6p-l-cdtB);将cdtC基因连接到表达载体pET(32a)和pGEX-6p-1,获得重组菌BL21(pET-cdtC)和BL21(pGEX-6p-l-cdtC)。经IPTG诱导后,离心收集菌体,进行SDS-PAGE鉴定。SDS-PAGE结果显示表达的蛋白与预期大小一致,His-CdtB、GST-CdtB大小为分别为29KD、53KD; His-CdtC、GST-CdtC大小分别为36KD、47KD。利用蛋白质的变复性获得纯化的蛋白His-CdtB和GST-CdtC,利用亲和层析柱纯化获得His-CdtC。Western-blot实验结果显示融合蛋白具有良好的免疫反应性。 二、基于CdtB蛋白检测空肠弯曲菌抗体的间接ELISA方法建立及初步应用 以纯化的His-CdtB作为包被原,用NCTC11168攻毒获得的血清作为阳性血清,建立了检测空肠弯曲菌CdtB抗体的间接ELISA方法,以方阵实验对ELISA条件进行优化,最终确定了ELISA反应条件：抗原包被浓度为16μg/mL;封闭液为10%的马血清；封闭时间为37℃,2h；最佳血清稀释液为PBS；血清稀释倍数为1：200；一抗作用时间为2h；二抗作用浓度为1：10000,作用时间为1h;显色时间为4min。应用优化的ELISA方法对60份鸡的血清样品进行测定,并采集相对应的鸡肛拭样品,进行细菌分离。结果显示分离到20份空肠弯曲菌,对分离株进行cdtB基因检测,18份呈阳性；ELISA检测有14份为阳性,2种实验方法的符合率为78%;应用建立的方法对388份人的血清样品进行测定,34份呈阳性,阳性率为8.76%。该检测方法的建立对空肠弯曲菌的血清流行病学研究等提供了新方法。 三、CdtB和CdtC单克隆抗体的制备和初步应用 以原核表达的GST-CdtB和GST-CdtC蛋白为免疫原,以His-CdtB、His-CdtC分别为检测原,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。获得5株稳定分泌CdtB抗体的细胞株,分别命名为1F3、1F5、2E4、2E11、2F2,2E11,单抗亚类为IgG2b,其它4株均为IgGl,腹水效价分别为1：3276800、1：6553600、1：819200、1：6553600、1：13107200；获得5株稳定分泌CdtC抗体的细胞株,分别命名为3A10、4D2、2E1、6E4、3G5,单抗亚类均为IgG1；腹水效价分别为1：6553600、1：3276800、1：1638400、1：13107200、1：1638400。Western-blot分析显示,每株单抗都能与相对应的融合蛋白发生发应,并出现特异性的条带,说明单抗具有良好的特异性。 选择Caco-2和HD-11细胞为模型,将2种抗体与NCTC11168中和1h后进行黏附和侵袭实验。结果显示,对于HD-11细胞,与2种抗体作用后的细菌的黏附和侵袭能力相对于对照组明显下降,加入CdtB抗体黏附率和侵袭率分别下降了28%、11%：加入CdtC抗体黏附率和侵袭率分别下降了27%、32%;同时加入CdtB和CdtC抗体黏附率和侵袭率分别下降了30%、47%；侵染HD-11细胞后的形态观察和细胞数目测定显示,只加入NCTC11168细菌的对照组的活细胞数为6.8×15个/mL；加入CdtB抗体后,活细胞数为1.4×106个/mL；加入CdtB和CdtC抗体后,活细胞数为2.6×106个/mL,加入抗体后的细胞存活率高于对照组。对照组的细胞明显肿胀,而加入抗体后的细胞肿胀数明显减少。对于Caco-2细胞,加入CdtB抗体,细菌的黏附和侵袭分别下降了73%、70%；加入CdtC抗体,细菌的黏附和侵袭分别下降了68%、70%;加入CdtB和CdtC抗体细菌的黏附和侵袭分别下降了71%、75%。研究显示CdtB和CdtC抗体具有一定的中和毒素的能力,加入抗体后能干扰细菌的黏附和侵袭能力。CdtB和CdtC单克隆抗体的制备为研究CdtB和CdtC蛋白的生物学功能和临床应用等方面奠定了基础。
【关键词】：空肠弯曲菌 细胞致死性肿胀毒素 CdtB CdtC蛋白 ELISA方法 单克隆抗体
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要2-5
• Abstract5-8
• 目录8-10
• 符号说明10-12
• 综述 细胞致死性肿胀毒素12-23
• 1 编码和/或产生CDT的细菌种类12-13
• 1.1 大肠杆菌12
• 1.2 志贺氏菌12-13
• 1.3 空肠弯曲杆菌13
• 1.4 其他细菌13
• 2 CDT的遗传学13-14
• 3 CDT结构14
• 4 CDT各组成部分的功能14-16
• 4.1 CdtB的功能14-15
• 4.2 CdtA/CdtC的功能15-16
• 5 CDT的作用机制16-17
• 6 CDT影响的细胞类型17
• 7 CDT作为一个可能的致病因素17-18
• 8 展望18
• 参考文献18-23
• 第一章 空肠弯曲菌细胞致死性肿胀毒素cdtB、cdtC的原核表达23-34
• 1 材料与方法23-26
• 1.1 材料23-24
• 1.2 方法24-26
• 2 结果26-31
• 2.1 cdtB和cdtC基因扩增26-27
• 2.2 PCR产物与克隆载体的连接27
• 2.3 重组原核表达质粒pET-cdtB、pGEX-6p-1-cdtB、pET-cdtC、pGEX-6p-1-cdtC的构建与鉴定27-28
• 2.4 cdtB,cdtC基因在重组菌中的表达28-31
• 3 讨论31-32
• 参考文献32-34
• 第二章 基于CdtB蛋白检测空肠弯曲菌抗体的间接ELISA方法建立及初步应用34-47
• 1 材料与方法34-36
• 1.1 材料34
• 1.2 方法34-36
• 2 结果36-45
• 2.1 CdtB蛋白的同源性分析36-37
• 2.2 阳性血清的制备37
• 2.3 蛋白包被浓度、血清稀释度的确定37-38
• 2.4 封闭液的选择38-39
• 2.5 封闭时间的确定39-40
• 2.6 血清稀释液的选择40
• 2.7 血清作用时间的确定40-41
• 2.8 二抗稀释度的确定41-42
• 2.9 二抗作用时间的确定42
• 2.10 显色时间的确定42-43
• 2.11 间接ELISA方法步骤的确定43
• 2.12 特异性实验43-44
• 2.13 重复性实验44
• 2.14 间接ELISA方法的初步应用44-45
• 3 讨论45-46
• 参考文献46-47
• 第三章 CdtB和CdtC单克隆抗体的制备和初步应用47-61
• 1 材料和方法47-51
• 1.1 材料47-48
• 1.2 方法48-51
• 2 结果51-58
• 2.1 间接ELISA检测方法的建立51-52
• 2.2 杂交瘤细胞株的建立52
• 2.3 单抗亚类、上清和腹水效价的测定结果52-53
• 2.4 单抗Western-blot试验53-54
• 2.5 中和抗体的选择54-55
• 2.6 基于CaCo-2细胞的黏附和侵袭实验55-56
• 2.7 基于HD-11细胞的黏附和侵袭实验56
• 2.8 HD-11细胞形态和细胞数目的变化56-58
• 3 讨论58-60
• 参考文献60-61
• 攻读硕士学位期间发表论文目录61-62
• 致谢62-63

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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3 徐婷婷;细胞致死性肿胀毒素及其研究进展[J];国外医学(儿科学分册);2004年02期

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本文编号：1038715