基于SILAC定量蛋白质组学的Pax4和caspase-6调控巨噬细胞替代活化研究

发布时间：2017-10-17 01:16

  本文关键词：基于SILAC定量蛋白质组学的Pax4和caspase-6调控巨噬细胞替代活化研究

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【摘要】：巨噬细胞是机体免疫系统的重要组成部分,分布于全身各处组织。受到组织微环境中各种信号刺激后,巨噬细胞会以不同方式发生活化,包括以吞噬和杀灭病原体为主要功能的经典活化和以免疫调控与组织修复为基本特征的替代活化。活化后的巨噬细胞在机体免疫和炎症反应中发挥重要作用,并参与调控各种生理和病理过程。然而,有关替代活化后巨噬细胞功能的改变和活化过程中关键调控分子的研究仍少有报道。本研究利用SILAC定量蛋白质组学技术,结合各种分子生物学技术手段对巨噬细胞替代活化过程细胞质膜蛋白质组和细胞全蛋白组进行定量分析,并基于变化蛋白所提供的信息,揭示了替代活化巨噬细胞吞噬功能的改变,鉴定了Pax4和caspase-6两个新的在巨噬细胞替代活化过程中发挥关键调控作用的分子。在我们的研究中,首先利用SILAC蛋白标记技术标记小鼠巨噬细胞株RAW2647,经过5次以上的细胞传代后保证轻标和重标氨基酸均完成各自的掺入过程。标记完成之后刺激巨噬细胞发生替代活化,其中轻标氨基酸掺入的RAW264.7细胞接受IL-4刺激发生替代活化,而重标氨基酸掺入的RAW264.7细胞作为对照。利用Biotin-Streptavidin亲和富集法分别提取上述两组细胞的质膜蛋白。等量混合(每种样品100μg)上述两种蛋白样品后,利用FASP方法完成蛋白样品的还原、烷基化和酶解过程。利用OFFGEL对酶解得到的肽段进行分离。分离得到的肽段脱盐之后进入液相色谱和串联质谱LTQ-Obitrap进行质谱鉴定并运用Maxqaunt软件处理得到的质谱数据完成质膜蛋白的鉴定和定量过程。最终我们获得了2238个蛋白的定量信息,其中108个蛋白表达水平发生显著变化。为了对巨噬细胞替代活化过程中蛋白的表达情况进行检测,我们还选取活化过程中5个时间点,对巨噬细胞替代活化过程进行动态蛋白质组学研究。我们仍然利用SILAC蛋白标记技术标记RAW264.7细胞。标记完成之后,经过轻标氨基酸掺入的RAW264.7细胞接受IL-4刺激发生替代活化,在不同的刺激时间点收集蛋白,而重标氨基酸掺入的RAW264.7作为对照；分别提取蛋白后,将IL-4刺激不同时间点获取的轻标蛋白分别与不经过IL-4刺激的重标蛋白(总共200μg,重标蛋白作为参照)等量混合进行蛋白质组定量实验,共定量3468个蛋白,其中342个蛋白表达水平发生显著变化。变化蛋白富集分析结果显示,吞噬作用通路富集的变化蛋白最多,为22个,且其中19个蛋白发生下调表达,表明替代活化巨噬细胞吞噬作用通路受到损伤。功能试验也证明替代活化巨噬细胞吞噬能力下降。对于变化蛋白上游调控分子生物信息学分析显示,转录因子Pax4可能参与调控巨噬细胞替代活化过程。基于此,我们首先检测了巨噬细胞替代活化过程中Pax4表达量的变化情况,结果表明Pax4表达量上调显著。为了进一步确认Pax4在巨噬细胞替代活化过程中的功能,我们利用构建的Pax4过表达和shRNA质粒,检测了Pax4表达量的变化对巨噬细胞替代活化过程中标志分子和细胞因子表达的影响,结果显示过表达Pax4可以促进巨噬细胞替代活化的发生,而Pax4表达量受到抑制后巨噬细胞替代活化过程则受到显著抑制。既然Pax4可以调控巨噬细胞替代活化过程,下一步实验中我们检测了Pax4是否同样是替代活化巨噬细胞吞噬功能的调节者。我们利用构建的Pax4过表达和shRNA质粒,检测了Pax4表达量的变化对替代活化巨噬细胞吞噬功能的影响,结果证实Pax4作为负向调控分子参与调控替代活化巨噬细胞吞噬功能。随后的机制研究表明,Pax4通过转录激活Bcl-xL的表达降低了胞浆内钙离子的浓度最终导致巨噬细胞吞噬功能的下降。肿瘤组织中的巨噬细胞称为肿瘤相关巨噬细胞,调控了肿瘤的发生发展过程。我们的研究还证实Pax4同样是肿瘤相关巨噬细胞生物学功能的调节分子,并且调控了肿瘤相关巨噬细胞吞噬能力的下降。定量蛋白质组学研究结果还证明caspase-6在替代活化过程中上调表达显著。基于此,我们首先检测了替代活化巨噬细胞内caspase-6的表达水平和活性变化,结果表明caspase-6的表达量和活性均显著上升。随后我们利用caspase-6抑制剂和RNA干扰技术进一步验证了caspase-6在巨噬细胞替代活化中的调控作用,结果证实c aspase-6可以调控替代活化标志分子的表达。利用生物信息学分析提供的信息,我们还证实p53作为上游分子参与调控caspase-6表达水平和活性的上升。另外,caspase-6同样是肿瘤相关巨噬细胞生物学功能的调节分子,并且通过调节MMP9的表达影响了肿瘤相关巨噬细胞对肿瘤细胞侵袭的促进作用。综上所述,本论文首次利用定量蛋白质组学技术描绘了巨噬细胞替代活化过程质膜蛋白质组和细胞全蛋白质组表达图谱,同时基于变化蛋白提供的线索发现并验证Pax4和caspase-6作为替代活化巨噬细胞和肿瘤相关巨噬细胞生物学功能的调节分子分别调控了巨噬细胞的吞噬能力和促肿瘤侵袭能力,扩展了我们对替代活化巨噬细胞功能改变和活化过程中关键调控分子的认识。
【关键词】：巨噬细胞 替代活化 定量蛋白质组学 Phagocytosis Pax4 caspase-6
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 缩略词5-6
• 摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 第一章 研究背景12-37
• 1 巨噬细胞简介12-17
• 1.1 天然免疫概念12-13
• 1.2 巨噬细胞13
• 1.3 巨噬细胞的异质性13-17
• 2 巨噬细胞活化分子机制研究进展17-28
• 2.1 巨噬细胞活化的信号通路17-22
• 2.2 巨噬细胞活化的重要调控分子22-28
• 3 巨噬细胞介导的机体生理与病理过程28-32
• 3.1 巨噬细胞与经典炎症28-29
• 3.2 脂肪组织巨噬细胞与胰岛素耐受29-30
• 3.3 肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤30-32
• 4 巨噬细胞蛋白质组学研究32-37
• 4.1 经典蛋白质组学技术在巨噬细胞功能研究中的应用34-35
• 4.2 以质谱为基础的蛋白质组学技术在巨噬细胞功能研究中的应用35-37
• 第二章 Pax4调控巨噬细胞替代活化37-80
• 1. 引言37-38
• 2. 实验材料与方法38-51
• 2.1 实验材料38-40
• 2.2 细胞培养与处理40
• 2.3 Q-PCR40-42
• 2.4 精氨酸酶活性测定42-43
• 2.5 ELISA43
• 2.6 流式分析43
• 2.7 细胞质膜蛋白提取43-44
• 2.8 免疫细胞化学与激光共聚焦显微镜观察44
• 2.9 细胞蛋白提取44-45
• 2.10 细胞质膜蛋白质组研究步骤45
• 2.11 溶液中酶解蛋白45-46
• 2.12 肽段分离与质谱鉴定46
• 2.13 免疫印迹46-47
• 2.14 细胞吞噬能力检测47
• 2.15 Pax4过表达质粒构建47-48
• 2.16 慢病毒制备48
• 2.17 细胞核蛋白提取48
• 2.18 EMSA48-49
• 2.19 ATP含量检测49-50
• 2.20 巨噬细胞吞噬肿瘤细胞能力检测50
• 2.21 原代肿瘤相关巨噬细胞分离50-51
• 2.22 胞浆内钙离子浓度检测51
• 2.23 数据处理51
• 3. 实验结果51-77
• 3.1 替代活化巨噬细胞模型构建51-52
• 3.2 细胞质膜蛋白提取52-55
• 3.3 质膜蛋白质组学结果55-57
• 3.4 动态蛋白质组学结果57-58
• 3.5 蛋白组数据分析58-59
• 3.6 替代活化巨噬细胞吞噬功能受到损伤59-62
• 3.7 巨噬细胞替代活化过程中Pax4表达水平和转录活性检测62-63
• 3.8 P-4调控巨噬细胞替代活化过程63-66
• 3.9 P-4调控替代活化巨噬细胞的吞噬功能66-71
• 3.10 TAM吞噬功能受到损伤71-72
• 3.11 Pax4调控TAM的功能表型72-74
• 3.12 Pax4调控TAM的吞噬功能74-77
• 4. 小结和讨论77-80
• 第三章 caspase-6调控巨噬细胞替代活化80-98
• 1 引言80-81
• 2 实验材料和方法81-83
• 2.1 实验材料81
• 2.2 caspase-6活性检测81-82
• 2.3 定量蛋白组学实验步骤82
• 2.4 细胞蛋白提取和胶内酶解82-83
• 2.5 Transwell小室肿瘤细胞侵袭实验83
• 3 实验结果83-95
• 3.1 巨噬细胞替代活化模型构建83-84
• 3.2 定量蛋白质组学结果84-87
• 3.3 替代活化过程信号通路变化87
• 3.4 caspase-6表达水平和活性检测87-89
• 3.5 caspase-6调控巨噬细胞替代活化过程89-91
• 3.6 caspase-6调控TAM功能表型91-92
• 3.7 caspase-6调控TAM促肿瘤细胞侵袭能力92-93
• 3.8 p53调控巨噬细胞替代活化过程中caspase-6的表达和活性93-95
• 4 小结与讨论95-98
• 参考文献98-107
• 致谢107-109

【共引文献】

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本文编号：1045974