金黄色葡萄球菌中clpP、clpX及SarZ重要致病基因功能的研究

发布时间：2017-10-18 05:05

  本文关键词：金黄色葡萄球菌中clpP、clpX及SarZ重要致病基因功能的研究

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【摘要】：金黄色葡萄球菌是重要的人类致病菌,酪蛋白裂解酶P(clpP)、酪蛋白裂解酶X(clpX)及葡萄球菌附属调节子Z (SarZ)是金黄色葡萄球菌中调节毒力因子的重要蛋白,clpP蛋白和clpX蛋白属于CLp蛋白水解酶,在生物体蛋白质代谢过程的调节和清除不可逆损伤蛋白的过程中发挥重要作用。SarZ蛋白属于SarA家族蛋白,是一个二聚体的DNA结合蛋白,它能和特异DNA区域结合来调控hla(溶血素基因)和附属基因调节系统(是S. aureus中最早发现的毒力因子调控因子之一,agr)。MgrA和SarZ蛋白是同系物都属于SarA家族蛋白,研究发现MgrAC12、SarA和SarZC13等蛋白分子半胱氨酸是关键的酶活中心,通过半胱氨酸的磷酸化修饰引起了蛋白质结构中氢键网络的变化而导致构象的变化,调节金黄色葡萄球菌毒力因子的产生以及细菌对万古霉素的抗性,主要研究结果分为两部分： 1.clpP蛋白水解酶底物研究 利用同源重组原理在newman基因组中成功敲除clpP基因。 clpP敲除突变体与野生型相比致病性明显下降。 通过pyj335::clpP质粒构建,进行基因功能互补实验,恢复到了野生型。 尿素酶琼脂板结果显示,尿素酶活性明显比野生型增加。 通过观察2%牛奶板,发现胞外蛋白酶活性也增加了。 利用红霉素(erm)抗性标记基因,在newman菌株中进行clpX敲除突变菌株的筛选。 利用细菌双杂交试剂盒,探究clpP和clpX蛋白在细菌体内的相互作用。 2.SarZ蛋白C13的半胱氨酸磷酸化修饰与DNA结合特性及毒力研究 研究表明在SarZ蛋白的C-、N-末端及螺旋转角螺旋(winged helix-turn-helix motif (wHTH))区域氨基酸进行一系列的点突变可以改变蛋白与DNA的结合能力。 通过电泳迁移率试验(EMS A),发现SarZ (C13E)突变以后能够减弱蛋白和DNA的结合能力,而SarZ (C13S)提高了与DNA的结合能力。 牛奶板结果也显示法对SarZ13C进行点突变以后能改变蛋白的折叠方式,造成蛋白特性与功能的改变。 SarZ蛋白中存在的半胱氨酸(cys)磷酸化修饰在金黄色葡萄球菌中是一种新的氧化还原蛋白的翻译后修饰方式。 通过对SarZ蛋白的研究,类推到SarA家族蛋白-MgrA[最近发现的金黄色葡萄球菌自溶和毒力调控因子),MgrA C12E进行点突变,研究蛋白结构改变对其功能的影响。ClpP和ClpX蛋白在金黄色葡萄球菌的生理和毒力方面具有重要作用,但对真正ClpP蛋白底物还不是很清楚,有待进一步研究。另外就是金黄色葡萄球菌中,SarZ C13存在的半胱氨酸磷酸化修饰,这种蛋白质的翻译后修饰作用可能也存于其它SarA家族蛋白,如MgrA和SarA (agr系统的调控因子)这种和SarZ蛋白具有高度氨基酸序列同源性的蛋白中。
【关键词】：金黄色葡萄球菌 SarA家族蛋白 CLp蛋白水解酶 细菌双杂交 同源重组
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 英文缩略词表(Abbreviation)10-11
• 1 前言11-16
• 2 材料与方法16-37
• 2.1 仪器16
• 2.2 试剂16-17
• 2.3 溶液及培养基的配制17-20
• 2.4 实验菌株及质粒20-21
• 2.5 引物21-22
• 2.6 实验方法22-37
• 2.6.1 金黄色葡葡萄球菌基因组提取22
• 2.6.2 大肠杆菌质粒提取22-23
• 2.6.3 金黄色葡菌球菌中质粒提取23-24
• 2.6.4 大肠杆菌的超级感受态制备24
• 2.6.5 金黄色葡萄球菌感受态制备24-25
• 2.6.6 构建pkor1：：clpP重组质粒25-27
• 2.6.7 clpP基因敲除27-30
• 2.6.8 细菌双杂交研究clpP和clpX蛋白互作30-31
• 2.6.9 clpP基因功能互补及过表达31
• 2.6.10 SarZ和MgrA蛋白定点突变31-32
• 2.6.11 噬菌体转导32-34
• 2.6.12 蛋白纯化34
• 2.6.13 蛋白热稳定分析34-35
• 2.6.14 电泳迁移率检测分析(EMSA)35-37
• 3 实验结果与分析37-54
• 3.1 clpP基因在newman基因组中的敲除37-42
• 3.1.1 穿梭质粒(△clpP-pkoRl)的构建37-39
• 3.1.2 RN4220修饰39-40
• 3.1.3 重组质粒电击转入newman菌株40
• 3.1.4 突变体的筛选40-42
• 3.2 clpX基因在newman基因组中的敲除42
• 3.2.1 pkorl：：clpX-上-erm-下重组质粒的构建42
• 3.2.2 RN4220修饰42
• 3.2.3 △clpX-pKOR1质粒电击转入newman42
• 3.2.4 突变体筛选42
• 3.3 clpX/clpP在newman基因组中的双敲除42-43
• 3.4 Western blot43
• 3.5 △clpP表型特征43-44
• 3.6 细菌双杂交质粒构建44-46
• 3.7 SarZ/MgrA家族蛋白的研究46-54
• 3.7.1 SarZ做了一些蛋白折叠相关的点突变(18个)46
• 3.7.2 蛋白小试SDS-page46-48
• 3.7.3 电泳迁移率实验(EMSA)48-50
• 3.7.4 蛋白最适buffer筛选和热稳定性分析50
• 3.7.5 胞外蛋白酶活性检测50-52
• 3.7.6 在SarZ的基础上进行另一类SarA家族蛋白—MgrA的研究52-54
• 4 总结与讨论54-58
• 参考文献58-64
• 致谢64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 刘金凤;王京兰;钱小红;蔡耘;;翻译后修饰蛋白质组学研究的技术策略[J];中国生物化学与分子生物学报;2007年02期

2 李建华;陈利玉;;细菌双杂交系统及其在病原微生物学中的应用[J];微生物学免疫学进展;2006年03期

3 王振海;孙野青;;Clp蛋白酶研究进展[J];药物生物技术;2005年06期

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本文编号：1053084