小鼠脂肪间充质干细胞的分离、鉴定与成肌诱导分化研究

发布时间：2017-10-18 21:34

  本文关键词：小鼠脂肪间充质干细胞的分离、鉴定与成肌诱导分化研究

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【摘要】：本研究运用Ⅰ型胶原酶消化法分离4周龄雌性ICR小鼠脂肪间充质干细胞(Adipose-derived stem cells, ADSCs),进行体外分离培养,随后观察传代生长过程中的形态变化,绘制生长曲线,进行染色体分析,和细胞周期的测定。随后用RT-PCR法对ADSCs进行转录因子的检测,流式细胞仪检测细胞表面标志CD29,CD31,CD44,CD45。结果显示小鼠ADSCs体外培养时呈成纤维细胞样,增殖速度快,各代次细胞经历生长潜伏期、指数生长期和平台期,生长状态无异常,细胞表面标志CD29阳性率为95.51%,CD44为31.63%,CD31为20.22%,CD45表达量极少。RT-PCR检测ADSCs的转录因子结果表明,小鼠ADSCs少量表达Oct-4和C-kit,大量表达Sca-1。可经成脂诱导体系诱导成为脂肪细胞,经过苏丹黑染色显蓝色,并表达PPARy2这一脂肪细胞分化过程中重要的调节因子。可经成骨诱导体系诱导成为成骨细胞,经过茜素红染色呈红色,并表达钙骨素基因。 用胶原酶和胰酶联合消化法消化分离小鼠原代肌肉卫星细胞,该方法比组织块等方法得到卫星细胞所用时间短。免疫荧光显示其表达FITC标记的Myod抗体和Cy3标记的Desmin抗体。RT-PCR结果显示,小鼠骨骼肌卫星细胞表达MyoD, Myogenin和Myf5等生肌决定因子,其中MyoD的表达量最高。不同代次之间不同生肌决定因子的表达量不同,新分离的骨骼肌卫星细胞和第二代细胞之间MyoD的表达量差异并不显著,而MyoG的表达量差异显著,而Myf5的表达量差异极其显著,说明骨骼肌卫星细胞在传代生长过程中,迅速地发生分化,逐渐变为生长成熟的成肌细胞,失去分化增殖能力。 用不同浓度去甲基化试剂5-氮杂胞苷(5-Aza)处理间充质干细胞寻找最佳培养条件后进行成肌检测。免疫荧光结果表明其定向分化为肌肉细胞的能力强,添加10μmol-L-15-Aza与10%的马血清(Horse Serum,HS)的条件培养基可使诱导效果更好。诱导后部分相邻细胞开始融合,形成类似肌管样的细胞,成肌特异性抗体anti-MyoD和anti-Desmin阳性表达。5-Aza单独诱导组、5-Aza与马血清(HS)协同诱导组与阴性对照脂肪间充质干细胞(ADSCs)组和阳性对照第一代骨骼肌卫星细胞(SCs)组,RT-PCR结果表明各组之间生肌决定因子MyoD,Myogenin和Myf5的表达量有差异,说明其成肌分化的程度不同,并有改善空间。 因此,本研究分离培养得到小鼠ADSCs,该细胞取材容易,带入杂质细胞很少,分离方法简便,体外生长增殖能力强,经多次传代后细胞仍生长稳定、增殖速度快、贴壁率高。并且在利用5-Aza以及优化的协同诱导体系可以在较短时间内使其诱导分化为成肌细胞样细胞,并具有表达生肌的标志性蛋白MyoD和肌肉骨架蛋白Desmin的能力,可以作为体外肌组织工程的种子细胞。
【关键词】：脂肪间充质干细胞 骨骼肌卫星细胞 成肌分化 生肌因子
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 表格索引7-8
• 图形索引8-11
• 摘要11-13
• ABSTRACT13-15
• 缩略词15-17
• 引言17-18
• 文献综述18-42
• 1 干细胞与间充质干细胞18-23
• 1.1 干细胞的定义与分类18-20
• 1.2 间充质干细胞的多能分化特性20-22
• 1.3 脂肪间充质干细胞的分离培养与性质22-23
• 2 肌肉形成与成肌诱导23-30
• 2.1 胚胎发育与细胞分化机理23-24
• 2.2 骨骼肌细胞发育和成肌调节的关键因子24-26
• 2.3 间充质干细胞的成肌诱导与机理26-30
• 3 体外肌肉组织工程30-34
• 3.1 种子细胞31
• 3.2 支架技术研究概况31-32
• 3.3 培养条件与生物反应器32-33
• 3.4 国内外“试管肉”研究组织概况33-34
• 4 结语34-36
• 参考文献36-42
• 第一章 小鼠ADSCs的分离、鉴定与生物学特性研究42-62
• 1 材料与方法42-48
• 1.1 试验材料42-44
• 1.2 试验方法44-48
• 2 结果与分析48-56
• 2.1 细胞培养与形态48-50
• 2.2 细胞不同代次的生长曲线50-51
• 2.3 细胞周期51
• 2.4 染色体分析51-52
• 2.5 小鼠ADSCs的表面标志鉴定结果52-55
• 2.6 鼠ADSCs的成脂染色结果55-56
• 2.7 小鼠ADSCs的成骨染色结果56
• 3 讨论56-60
• 参考文献60-62
• 第二章 小鼠骨骼肌卫星细胞的分离与鉴定研究62-76
• 1 材料与方法63-66
• 1.1 试验材料63
• 1.2 试验方法63-66
• 2 结果与分析66-72
• 2.1 培养细胞生长特性66-67
• 2.2 生长曲线67-68
• 2.3 小鼠骨骼肌卫星细胞的核型分析68
• 2.4 小鼠骨骼肌卫星细胞的免疫荧光鉴定68-70
• 2.5 小鼠骨骼肌卫星细胞的RT-PCR鉴定70-72
• 3 讨论72-74
• 参考文献74-76
• 第三章 小鼠脂肪间充质干细胞的成肌诱导分化与鉴定76-90
• 1 材料与方法76-79
• 1.1 试验材料76-77
• 1.2 试验方法77-79
• 2 结果与分析79-86
• 2.1 诱导剂5-Aza的浓度效应的测定结果79-80
• 2.2 ADSCs在最佳诱导浓度中的凋亡检测80-81
• 2.3 ADSCs经过不同诱导后细胞形态的变化81-82
• 2.4 ADSCs诱导后免疫荧光检测82-84
• 2.5 诱导后不同组生肌基因的RT-PCR检测84-86
• 3 讨论86-88
• 参考文献88-90
• 全文结论90-92
• 创新说明92-94
• 研究展望94-96
• 附录96-98
• 致谢98-100
• 攻读硕士学位期间发表论文100

【参考文献】

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本文编号：1057274