特异性抑制巨噬细胞ACT1表达对动脉粥样硬化斑块形成的影响及机制研究

发布时间：2017-10-19 16:24

  本文关键词：特异性抑制巨噬细胞ACT1表达对动脉粥样硬化斑块形成的影响及机制研究

  更多相关文章： 动脉粥样硬化 NF-κB 活化因子1 ApoE-/-小鼠 巨噬细胞 腹腔巨噬细胞 泡沫细胞 dil-oxLDL 巨噬细胞 THP-1 JNK p-38MAPK NF-kB CD36 ACT1

【摘要】：第一章特异性抑制巨噬细胞ACT1表达对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成的作用研究 目的： 动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是以动脉壁脂质沉着，形成粥糜状病灶及纤维增生使管壁变硬为特征的多因素疾病。其关键在于血管内皮损伤导致脂质沉积于动脉壁内皮下层，诱导单核细胞迁移至内皮下吞噬脂质进而导致泡沫细胞大量沉积，引发一系列炎症和免疫反应等复杂的病理进程，最终导致动脉粥样斑块的形成。研究表明NF-κB活化因子1（nuclear factor kappa B activator1，ACT1）主要介导细胞因子IL-17信号通路的活化并参与炎症反应。但是否特异性抑制巨噬细胞的ACT1表达会影响动脉粥样硬斑块形成，目前尚未见报道。因此在这一部分我们以ApoE-/-小鼠和ApoE-/-; Anti-ACT1小鼠为研究对象，用高脂饲料诱导建立动脉粥样硬化模型，深入研究特异性抑制巨噬细胞ACT1表达对动脉粥样斑块形成的影响。 方法： 将Anti-ACT1小鼠和ApoE-/-小鼠进行杂交，获得稳定的ApoE-/-; Anti-ACT1小鼠，分别取ApoE-/-和ApoE-/-; Anti-ACT1雄性小鼠（8-10周龄）各20只，以高脂饲料诱导8周，收集各组织样本。油红O染色观察两种小鼠主动脉根部斑块形成以及胸腹主动脉斑块面积；免疫组化分析粥样斑块中巨噬细胞的浸润情况，用免疫荧光分析ACT1在动脉粥样硬化斑块中的表达和定位情况。 结果： 1.高脂饲料诱导的ApoE-/-;Anti-ACT1及ApoE-/-小鼠体重均随喂养时间有明显增加，但在各时间点两组小鼠的体重无显著性差异。 ApoE-/-; Anti-ACT1小鼠的主动脉根部及胸腹主动脉斑块面积明显小于ApoE-/-小鼠。与ApoE-/-小鼠相比，ApoE-/-; Anti-ACT1小鼠主动脉根部动脉粥样斑块中巨噬细胞的浸润数量有显著减少。ApoE-/-;Anti-ACT1小鼠血清TC和LDL-C的水平与ApoE-/-小鼠相比明显降低，HDL-C和TG水平没有显著性差异。 结论： 特异性抑制巨噬细胞ACT1表达后能够抑制动脉粥样硬化斑块的形成并减少主动脉根部斑块中巨噬细胞的浸润，同时显著降低高脂诱导的小鼠血清TC和LDL-C的水平。ACT1主要在动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞上有表达。 第二章特异性抑制巨噬细胞ACT1表达对泡沫细胞形成的影响 目的： 第一部分研究结果显示特异性抑制巨噬细胞ACT1表达后可显著抑制动脉粥样硬化斑块形成和明显减少斑块中巨噬细胞浸润，且ACT1蛋白仅在动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞上有表达。由于动脉粥样斑块与巨噬细胞吞噬脂质进而导致泡沫细胞沉积有密切关系。因此，我们提出是否ACT1参与了泡沫细胞形成？本部分旨在进一步研究特异性抑制巨噬细胞ACT1表达后对泡沫细胞形成的影响。 方法： 分别提取8-10周龄ApoE-/-和ApoE-/-;Anti-ACT1小鼠腹腔巨噬细胞，用dil-oxLDL分别处理37℃6h和4℃2h，荧光共聚焦显微镜下观察不同来源巨噬细胞对oxLDL结合和吞噬的情况，另外用oxLDL处理不同来源巨噬细胞24h后，油红O染色观察泡沫细胞形成的差异。 结果： 1.与ApoE-/-小鼠相比，ApoE-/-; Anti-ACT1小鼠腹腔巨噬细胞在dil-oxLDL处理后细胞吞噬dil-oxLDL量明显减少。 2.与ApoE-/-小鼠相比，ApoE-/-; Anti-ACT1小鼠腹腔巨噬细胞在oxLDL处理后，泡沫细胞数量显著降低。 结论： 特异性抑制巨噬细胞ACT1表达可显著抑制oxLDL诱导的巨噬细胞吞噬作用和泡沫细胞形成。 第三章特异性抑制巨噬细胞ACT1表达对泡沫细胞形成的作用机制 目的： 泡沫细胞的形成目前证实主要与巨噬细胞上清道夫受体（CD36和SR-A）以及转运蛋白（ABCA1/ABCG1）的表达和活化异常有密切关系，而MAPKs（JNK和p38MAPK）信号途径活化被证实参与调控泡沫细胞形成和清道夫受体的表达。ACT1作为IL-17细胞因子信号途径下游的适配器蛋白主要介导NF-κB转录因子的活化和炎症反应，但同时研究也显示ACT1还可介导MAPK信号途径的活化，因此基于我们前两部分的研究结果，在本部分中，我们在体外原代和人单核细胞株上进一步探讨ACT1调控泡沫细胞形成的信号分子机制。 方法： 分别提取8-10周龄ApoE-/-和ApoE-/-;Anti-ACT1雄性小鼠的腹腔巨噬细胞，用oxLDL（80ug/ml）处理24h后检测清道夫受体（CD36和SR-A）以及转运蛋白（ABCA1/ABCG1）的表达变化，并用western blot加以验证。另外，体外培养人单核细胞株（THP-1），经PMA诱导后贴壁转变为巨噬细胞，用oxLDL诱导24h和48h，检测ACT1及吞噬相关基因和蛋白水平的变化。进一步用siRNAACT1对THP-1细胞中ACT1进行抑制观察oxLDL诱导48h后对MAPKs和NF-κB相关信号分子的表达作用，最后，用NF-κB抑制剂，oxLDL诱导48小时后，观察泡沫细胞形成情况以及其对MAPKs和CD36的作用。 结果： 1与ApoE-/-小鼠相比，，ApoE-/-; Anti-ACT1小鼠巨噬细胞在oxLDL诱导后，CD36的mRNA水平明显降低。 2与对照组相比，THP-1细胞经oxLDL处理24h和48h后均可诱导泡沫细胞形成，且CD36和ACT1蛋白水平在处理48h后均明显提高。 3.在THP-1细胞中，ACT1siRNA后对oxLDL诱导的泡沫细胞形成数量较单纯oxLDL处理组明显降低，同时CD36，p-P65，p-P38，p-JNK和JNK2的表达均明显降低。 4.与单纯oxLDL处理组相比，外源性NF-κB抑制剂（PDTC）对oxLDL诱导48h后的THP-1泡沫细胞形成无明显抑制作用，且对p-P38磷酸化水平和CD36的表达也无显著影响，但可显著抑制p-P65磷酸化水平和p-JNK和JNK2蛋白水平。 5. ELISA检测结果显示，高脂诱导后ApoE-/-小鼠血清中IL-17的水平随动脉粥样硬化的发展有逐渐降低的趋势，且高脂诱导8周后ApoE-/-小鼠血清中的IL-17水平与ApoE-/-; Anti-ACT1小鼠相比，无显著差异。 结论： 1. ACT1参与oxLDL诱导的泡沫细胞形成。 2. ACT1介导泡沫形成可能主要通过调控下游的p38，JNK蛋白磷酸化影响CD36的表达进而影响巨噬细胞对oxLDL的吞噬。 3.ACT1介导泡沫细胞形成可能不依赖IL-17/ACT1/NF-κB经典炎症信号途径活化，而是ACT1可能直接通过调控MAPKs磷酸化水平调控CD36表达影响泡沫细胞形成。
【关键词】：动脉粥样硬化 NF-κB 活化因子1 ApoE-/-小鼠 巨噬细胞 腹腔巨噬细胞 泡沫细胞 dil-oxLDL 巨噬细胞 THP-1 JNK p-38MAPK NF-kB CD36 ACT1
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363
【目录】：

• 中文摘要6-10
• Abstract10-14
• 前言14-22
• 1. 动脉粥样硬化研究进展14-16
• 2. 动脉粥样硬化中泡沫细胞形成16-18
• 3. ACT1在炎症及免疫反应中的作用18-20
• 4. IL-17A与动脉粥样硬化20-22
• 第一章 特异性抑制巨噬细胞 ACT1 表达对 ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成的影响22-39
• 1.1 实验材料22-24
• 1.1.1 实验动物22
• 1.1.2 实验仪器22-23
• 1.1.3 主要试剂23
• 1.1.4 主要抗体23-24
• 1.2 实验方法24-33
• 1.2.1 动物的鉴定与饲养24-28
• 1.2.3 基因工程小鼠的扩群繁殖及动脉粥样硬化模型的建立28-29
• 1.2.4 血脂分析29
• 1.2.5 主动脉动脉粥样硬化斑块形成的评价29-31
• 1.2.6 免疫组化和免疫荧光染色31-33
• 1.2.7 统计学分析33
• 1.3 实验结果33-37
• 1.3.1 Antisense-ACT1(Anti-ACT1)对小鼠腹腔巨噬细胞 ACT1 表达的影响33-34
• 1.3.2 特异性抑制巨噬细胞 ACT1 表达对 ApoE-/-小鼠体重的影响34
• 1.3.3 特异性抑制巨噬细胞 ACT1 表达对高脂诱导的不同时间点小鼠血脂水平的影响34-35
• 1.3.4 特异性抑制巨噬细胞 ACT1 表达对 ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成的影响35-36
• 1.3.5 特异性抑制巨噬细胞 ACT1 表达对动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞浸润的影响36-37
• 1.3.6 ACT1 蛋白在动脉粥样硬化斑块中的表达及定位37
• 1.4 本章小结37-39
• 第二章 特异性抑制巨噬细胞 ACT1 表达对泡沫细胞形成的影响39-44
• 2.1 材料39-40
• 2.1.1 实验动物及细胞39
• 2.1.2 实验仪器39-40
• 2.1.3 实验试剂40
• 2.2 实验方法40-41
• 2.2.1 动物的饲养与鉴定40
• 2.2.2 小鼠腹腔巨噬细胞的获取40
• 2.2.3 腹腔巨噬细胞体外 oxLDL 诱导泡沫化形成模型的建立40-41
• 2.2.4 泡沫化细胞鉴定41
• 2.2.5 巨噬细胞摄取 oxLDL 的实验41
• 2.2.6 统计学分析41
• 2.3 结果41-43
• 2.3.1 抑制 ACT1 表达对腹腔巨噬细胞吞噬 oxLDL 的影响41-42
• 2.3.2 抑制 ACT1 表达对腹腔巨噬细胞泡沫化形成的影响42-43
• 2.4 本章小结43-44
• 第三章 特异性抑制巨噬细胞 ACT1 表达在减轻泡沫细胞形成中的机制研究44-61
• 3.1 材料44-46
• 3.1.1 实验动物及细胞44
• 3.1.2 实验仪器44-45
• 3.1.3 实验试剂45-46
• 3.1.4 主要抗体46
• 3.2 实验方法46-53
• 3.2.1 腹腔巨噬细胞总 RNA 的提取46
• 3.2.2 RNA 的反转录及 qPCR46-47
• 3.2.3 人单核细胞株 THP-1 细胞培养47-48
• 3.2.4 针对 ACT1 蛋白的 siRNA 链干扰效率筛选48
• 3.2.5 THP-1 细胞总 RNA 的提取48-49
• 3.2.6 利用 oxLDL 诱导 THP-1 细胞建立泡沫化细胞模型49
• 3.2.7 RNA 的反转录及 qPCR49
• 3.2.8 Western blot49-52
• 3.2.9 统计学分析52-53
• 3.3 结果53-59
• 3.3.1 抑制 ACT1 表达对清道夫受体及转运蛋白表达的影响53-54
• 3.3.2 THP-1 泡沫细胞模型评价54
• 3.3.3 单核细胞 THP-1 源巨噬细胞中 ACT1 与 CD36 的表达变化54-55
• 3.3.4 siRNA ACT1 对 THP-1 细胞泡沫化的影响55-56
• 3.3.5 siRNA ACT1 对 THP-1 细胞中泡沫化形成相关信号蛋白分子表达的影响56-57
• 3.3.6 外源性抑制 NF-κB 对 THP-1 细胞泡沫化及相关信号蛋白分子表达的影响57-58
• 3.3.7 IL-17 在小鼠动脉粥样硬化进程中的变化58-59
• 3.4 本章小结59-61
• 讨论61-64
• 参考文献64-69
• 攻读硕士研究生学位期间发表的论文69
• 附录一：缩写词中英文对照69-70
• 致谢70-71

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