复制型乙型肝炎病毒载体表达病毒白细胞介素10建立小鼠感染模型

发布时间：2017-10-21 05:37

  本文关键词：复制型乙型肝炎病毒载体表达病毒白细胞介素10建立小鼠感染模型

  更多相关文章： cmvIL-10 ebvIL-10 HBV感染 小鼠 动物模型 水动力法

【摘要】：自从1963年Blumberg发现澳大利亚抗原以来,乙型肝炎病毒(HBV)感染一直是严重威胁人类健康的原因之一。慢性HBV感染所引起的慢性乙型病毒性肝炎及其相关疾病(如肝衰竭、肝硬化、肝癌等)是严重危害人类健康的疾病。目前尚无可靠的HBV动物模型,严重阻碍了HBV相关基础和临床研究。因此,建立易获取、经济适用、生物学背景清晰的小动物HBV感染模型尤为重要。小鼠是医学研究领域常用的实验动物,但是,乙肝病毒的种属特异性使得正常情况下HBV不能感染小鼠。HBV转基因小鼠模型、人鼠嵌合小鼠HBV模型目前己经在一定范围内得到应用,但是这些模型的制备技术要求较高、制备难度大、免疫缺陷和肝细胞来源困难等因素也限制了其应用。水动力学方法建立的HBV转染小鼠模型为HBV相关研究提供了很好的动物模型,该模型制备具有经济实用、简单易行等优点,尤其适用于HBV感染免疫发病机制、机体免疫调节、抗病毒药物筛选等方面的研究。多种病毒通过发展各自的策略逃避宿主免疫,从而形成宿主的慢性感染。很多病毒的基因产物可以减轻宿主的免疫反应,避免免疫监视与免疫清除,为病毒的持续存在提供良好的环境,从而成功地感染具有健全免疫系统的机体,实现与宿主共存。人疱疹病毒中的人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)和EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)都可以编码病毒白细胞介素10(interleukin10,IL-10)类似物,这些IL-10类似物主要是抑制局部的免疫反应,以增强病毒复制、播散并持续存在。本研究拟借用人巨细胞病毒和EB病毒的生存策略,通过制备表达人巨细胞病毒白细胞介素10(Human Cytomegalovirus interleukin10,cmvIL-10)、EB病毒白细胞介素10(Epstein-Barr virus interleukin10,ebvIL-10)的复制型HBV载体,用水动力学的方法探讨建立小鼠HBV慢性感染模型的可行性。第一部分表达cmvIL-10、ebvIL-10的复制型HBV载体的构建目的:把HBV改造为表达cmvIL-10、ebvIL-10的复制型HBV载体,分析其分子生物学特性及对小鼠免疫功能是否有抑制作用。方法:1应用基因重组技术,构建了如下2个质粒:pCH-cmvIL-10、pCH-ebvIL-10。以表达野生型HBV的质粒pCH-3093为母质粒,插入外源基因cmvIL-10和ebvIL-10,构建表达人巨细胞病毒白细胞介素10(cmvIL-10)的质粒pCH-cmvIL-10、表达EB病毒白细胞介素10(ebvIL-10)的质粒pCH-ebvIL-10。2复制型HBV载体分子生物学特性的观察:上述重组型HBV质粒以表达野生型HBV的质粒pCH-3093为对照,分别转染至Hep G2细胞中,提取细胞培养液和细胞裂解液中的DNA,Southern blot检测HBV的复制能力,Northern blot检测HBV m RNA表达的变化。Native western blot检测HBV核心蛋白的表达。3两种病毒IL-10对小鼠免疫功能的抑制活性检测pCH-cmvIL-10、pCH-ebvIL-10和pCH-3093(对照)分别转染293细胞,收集含IL-10的细胞培养上清液。分离小鼠外周血单核细胞,给予LPS刺激,同时给予含有病毒IL-10的细胞培养上清液处理,应用实时定量RT-PCR检测单核细胞内MHC-II m RNA和TNF-αm RNA的表达,以观察两种病毒IL-10对小鼠免疫功能的抑制作用。结果:1本研究将HBV的P和C基因重叠区域分开,通过插入外源基因cmvIL-10、ebvIL-10,利用2个IRES序列,成功构建了表达cmvIL-10和ebvIL-10的复制型HBV载体质粒pCH-cmvIL-10、pCH-ebvIL-10,经酶切及测序鉴定,与理论设计相同。2为观察构建的2种HBV载体的复制能力,通过Southern blot检测,发现此两个质粒复制能力与野生型HBV相比,略有下降。3为观察2种HBV载体mRNA表达水平变化,通过Northern blot检测,发现两种HBV载体由于外源基因的插入,pg RNA电泳较野生型HBV稍慢,sg RNA与野生型HBV一致。4为观察两种HBV载体是否对HBV核心蛋白有影响,通过Native western blot检测,证实所构建的上述HBV载体对核心蛋白表达无影响,与野生型HBV一致。5为观察两种病毒IL-10对小鼠免疫功能的抑制活性,通过实时定量RT-PCR检测发现,小鼠单核细胞内MHCII m RNA和TNF-αm RNA的表达与对照组相比有不同程度的下降,表明两种病毒IL-10在细胞水平对小鼠免疫功能的有抑制作用。结论:1把HBV的P和C基因重叠区域分开,通过插入外源基因cmvIL-10、ebvIL-10,利用2个IRES序列,分别用于表达外源基因和P蛋白,成功构建了可表达cmvIL-10、ebvIL-10的复制型HBV载体,且对HBV分子生物学特性无明显影响。2本研究所构建的2种复制型HBV载体在细胞水平对小鼠免疫功能均有抑制作用。第二部分利用水动力学方法制备重组HBV小鼠感染模型目的:水动力学方法构建重组HBV的小鼠HBV感染模型。方法:1将清洁喂养、体重为22-25g、6-8周龄的Balb/c雄性小鼠,随机等分为三组:1.pCH3093组;2.pCH-cmvIL-10组;3.pCH-ebvIL-10组。每组32只。2采用水动力注射法,每只动物给予15ug质粒,加入总体积为0.l ml/g(体重)的生理盐水中,5-7秒钟内通过尾静脉注入小鼠体内。3按照以下时间点:注射后第l、3、5、7、10、14、21、28、60天,每个时相点每组随机取3只小鼠眼眶取血并取肝组织,测定如下指标:(1)ELISA测定小鼠血清中HBs Ag、HBe Ag;(2)免疫组织化学检测肝组织中的HBcAg的表达。结果:水动力法注射HBV重组质粒pCH-ebvIL-10后,能够在小鼠肝组织中检测到较高水平的HBc Ag,并能在小鼠血清中检测到HBs Ag和HBe Ag,且与野生型HBV组相比,感染时间有所延长。而pCH-cmvIL-10组HBV在肝组织及血清中的表达均较弱。结论:表达ebvIL-10的复制型HBV载体pCH-ebvIL-10可用于构建小鼠HBV感染模型,较野生型HBV感染时间有所延长。
【关键词】：cmvIL-10 ebvIL-10 HBV感染 小鼠 动物模型 水动力法
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R512.62;R-332
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-12
• 英文缩写12-14
• 引言14-16
• 第一部分 表达cmvIL-10、ebvIL-10 的复制型HBV载体的构建16-45
• 前言16-18
• 材料与方法18-32
• 结果32-34
• 附图34-40
• 讨论40-41
• 参考文献41-45
• 第二部分 利用水动力学方法制备重组HBV小鼠感染模型45-56
• 前言45-47
• 材料与方法47-48
• 结果48-49
• 附图49-52
• 讨论52-54
• 参考文献54-56
• 结论56-57
• 综述 病毒编码的IL-10 类似物及其对宿主免疫功能的控制57-65
• 参考文献62-65
• 致谢65-66
• 个人简历66

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本文编号：1071617