重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白临床新靶点研究

发布时间：2017-10-22 19:04

  本文关键词：重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白临床新靶点研究

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【摘要】：重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白（简称TNHH）在白细胞抑制因子（NIF）和水蛭肽（Hirulog）中间加入了一段交联肽，能与血凝块中纤维蛋白结合的导向性，实现了降低NIF和Hirulog片段的风险性，增加有效性的目的，能有效抑制白细胞活化、迁移、粘附功能，抑制凝血酶活性、血细胞与纤维蛋白结合。本品在急性缺血性脑卒中动物模型中具有多重功效，能有效促进脑组织损伤修复和保护，改善局部抗凝微循环和血流再灌注，抑制凝血酶引起的脑水肿，促进脑血肿的吸收。目的： 探讨重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白临床新靶点。 方法： 取健康人的纤维蛋白原（FIB）、抗凝血酶II（IAT-III）和纤维蛋白溶酶原（PLG）分别与TNHH进行体外结合实验，具体采用免疫印迹鉴别实验及分别结合HPLC分析，抗凝血酶III（AT-III）活性分析，D-二聚体转化实验中的D-二聚体含量测定分析判定。在上述实验判定靶点基础上，利用CADD（计算机辅助药物设计）与可能的新靶点纤维蛋白原（FIB），抗凝血酶II（IAT-III）和纤维蛋白溶酶原（PLG）进行分子对接（DOCK），采用PSIPRED2.4，Sybyl8.0和Discovery Studio2.5软件进行靶点验证结果。 结果： 重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白（TNHH)分别与纤维蛋白原（FIB），抗凝血酶III（AT-III）和纤维蛋白溶酶原（PLG）进行免疫印迹鉴别实验，兔抗TNHH多抗与TNHH+FIB和TNHH+AT-III实验组的免疫印迹结果呈阴性，而与TNHH+PLG实验组的免疫印迹结果呈阳性。鼠抗纤维蛋白原（FIB）单抗，鼠抗凝血酶III（AT-III）单抗分别与TNHH+FIB和TNHH+AT-III实验组的免疫印迹结果呈阴性，而鼠抗维蛋白溶酶原（PLG）单抗和TNHH+PLG的免疫印迹结果呈阳性。这说明TNHH中不含有纤维蛋白原（FIB）或抗凝血酶III（AT-III），而TNHH中含有维蛋白溶酶原（PLG），表示TNHH与FIB或AT-III无结合，而与PLG有结合。将纤维蛋白原（FIB）与TNHH进行体外结合实验的HPLC分析，结果显示：标准对照TNHH的保留时间为16.335min，峰面积为33578168.000；阳性对照TNHH+兔抗TNHH多抗中TNHH的保留时间为16.095min，峰面积为13985716.804；实验组TNHH的保留时间为15.655min，峰面积为34964292.010；这表明标准对照中的TNHH和实验组中的TNHH峰面积并没有太大差异，表明FIB与TNHH无结合。将抗凝血酶III（AT-III）与TNHH进行体外结合实验的AT-III：A活性分析，结果显示：标准对照AT-III的活性为104.7%，阳性对照AT-III的活性为48%，实验组AT-III的活性为109.3%，这表明标准对照AT-III和实验组AT-III的活性二者之间并没有显著的差异，说明抗AT-III与TNHH无结合，不能抑制抗凝血酶III的活性。将纤维蛋白溶酶原（PLG）与TNHH进行体外结合实验的D-二聚体转化实验分析，结果显示：阳性对照有D-二聚体生成，并且含量为0.246mg/L。实验组有D-二聚体生成，并且含量为0.068mg/L。这说明纤维蛋白溶酶原（PLG）与TNHH有结合，产生纤维蛋白溶酶，纤维蛋白溶酶催化纤维蛋白降解生成D-二聚体。通过计算机辅助药物设计（CADD）的PSIPRED，Sybyl8.0和Discovery Studio2.5软件分析，纤维蛋白溶酶原（PLG）C端的第153位Arg至175位的Tyr为一段保守序列RNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDY与重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白（TNHH）的C端的第133位Lys至140位的Tyr为一段保守序列KEGEGVLY在蛋白质的空间结构中存在相互作用，而纤维蛋白原（FIB）和抗凝血酶III(AT-III)均没有功能核心区域与TNHH之间有相互作用。 结论： 通过免疫印迹鉴别实验，HPLC实验，AT-III：A活性实验和D-二聚体转化实验分析，以及结合PSIPRED，Sybyl8.0和Discovery Studio软件进行靶点验证分析。可以初步得出结论是：TNHH临床新靶点为纤维蛋白溶酶原（PLG）。
【关键词】：重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白（TNHH） 纤维蛋白原（FIB） 抗凝血酶III（AT-III） 纤维蛋白溶酶原（PLG）
【学位授予单位】：重庆理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 目录9-11
• 1. 引言11-33
• 1.1 急性脑卒中病理机理12-14
• 1.2 TNHH 的临床研究资料14-15
• 1.3 TNHH 与 UK-279.276 的比较15-20
• 1.4 TNHH 与 Hirulog 的比较20-21
• 1.5 CD11b/CD18 的生物作用和 NIF 介绍21
• 1.6 凝血酶的阴离子结合区的生物作用和 Hirulog 介绍21-22
• 1.7 重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白（TNHH）的创新性22-25
• 1.7.1 TNHH 的设计思路22-23
• 1.7.2 TNHH 双靶点设计的思路23
• 1.7.3 TNHH 的结构组成及创新性23
• 1.7.4 TNHH 的可行性23-24
• 1.7.5 嵌合表达的目的24-25
• 1.8 TNHH 双靶点功能特点与验证25-28
• 1.8.1 TNHH 双靶点功能特点25-27
• 1.8.2 TNHH 双靶点验证27-28
• 1.9 TNHH 临床新靶点研究对象依据28-31
• 1.10 TNHH 临床新靶点研究技术路线31-33
• 2. TNHH 临床新靶点研究实验方法33-49
• 2.1 取健康人的纤维蛋白原（FIB）与 TNHH 进行体外结合实验33-37
• 2.1.1 TNHH 与 FIB 的免疫印迹鉴别实验33-36
• 2.1.2 TNHH 与 FIB 的高效液相色谱法（HPLC 外标法）36-37
• 2.2 取健康人的抗凝血酶 III（AT-III）与 TNHH 进行体外结合实验37-42
• 2.2.1 TNHH 与 AT-III 的免疫印迹鉴别实验37-40
• 2.2.2 TNHH 与 AT-III 的抗凝血酶 III:A 活性检测（发色底物显色法）40-42
• 2.3 取健康人的纤维蛋白溶酶原（PLG）与 TNHH 进行体外结合实验42-47
• 2.3.1 TNHH 与 PLG 的免疫印迹鉴别实验42-45
• 2.3.2 TNHH 与 PLG 的 D-二聚体转化实验（ELISA 法）45-47
• 2.4 重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白（TNHH）的 CADD 靶点验证47-49
• 2.4.1 重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白（TNHH）分别与 FIB，AT-III 和 PLG 进行分子对接（DOCK）实验47-49
• 3. TNHH 临床新靶点研究实验结果与实验讨论49-69
• 3.1 取健康人的纤维蛋白原（FIB）与 TNHH 进行体外结合实验结果49-52
• 3.1.1 TNHH 与 FIB 免疫印迹鉴别实验结果49-50
• 3.1.2 TNHH 与 FIB 的分子筛 HPLC 外标法分析结果50-51
• 3.1.3 实验讨论51-52
• 3.2 取健康人的抗凝血酶 III 与 TNHH 进行体外结合实验结果52-55
• 3.2.1 TNHH 与 AT-III 免疫印迹鉴别实验结果52-53
• 3.2.2 TNHH 与 AT-III 的 AT-III：A 活性分析结果53-54
• 3.2.3 实验讨论54-55
• 3.3 取健康人的纤溶酶原（PLG）与 TNHH 进行体外结合实验结果55-58
• 3.3.1 TNHH 与 PLG 免疫印迹鉴别实验结果55-56
• 3.3.2 TNHH 与 PLG 的 D-二聚体转换实验结果56-57
• 3.3.3 实验讨论57-58
• 3.4 重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白（TNHH）的靶点验证结果58-69
• 3.4.1 TNHH 与 FIB、AT-III 和 PLG 的 CADD 靶点验证实验结果58-67
• 3.4.2 实验讨论67-69
• 4. 全文讨论与结论69-79
• 4.1 讨论69-78
• 4.1.1 展望77
• 4.1.2 不足之处77-78
• 4.2 结论78-79
• 致谢79-81
• 参考文献81-85
• 附录 英文缩写索引85-87
• 个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果87

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 葛月宾;王丽君;廖矛川;;计算机辅助药物设计的应用[J];科技创业月刊;2008年12期

2 郑彦;吕莉;;计算机辅助药物设计在药物合成中的应用[J];齐鲁药事;2008年10期

3 李洪林,沈建华,罗小民,沈旭,朱维良,王希诚,陈凯先,蒋华良;虚拟筛选与新药发现[J];生命科学;2005年02期

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本文编号：1079659