日本血吸虫两种酪氨酸酶的研究

发布时间：2017-10-24 09:29

  本文关键词：日本血吸虫两种酪氨酸酶的研究

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【摘要】：血吸虫病广泛流行于全世界76个国家和地区,是一种重要的人兽共患寄生虫病,虫卵是其主要的致病因素。我国流行的是日本血吸虫病。世界卫生组织认为药物和疫苗结合使用是长期有效控制血吸虫病的策略。目前治疗血吸虫病的药物主要有吡喹酮和青蒿素两种,品种单一而且治病机制不明确,长期使用将会导致抗药性的出现；另一方面,临床上尚缺乏有效防治血吸虫病的疫苗。因此,亟待发现有效的抗血吸虫疫苗和新药物,其前提是新疫苗和药物靶点的发掘。 酪氨酸酶(Tyrosinase)在吸虫类动物产卵过程中发挥着重要的作用。在本研究中,从日本血吸虫基因库中,检索出编码两种酪氨酸酶蛋白(SjTYR1,SjTYR2)的编码序列。使用生物信息学方法对序列进行分析并与其他物种同源蛋白氨基酸序列进行比对分析。编码两种酪氨酸酶的序列中都具有典型的酪氨酸酶结构域,包括两个铜离子结合区和一个高度保守的半胱氨酸富集区。与其他物种同源蛋白序列联配分析结果显示,与人源的同源序列相似度较低(仅为24%),可作为潜在的药物靶点。使用Real-time PCR分析不同时期的雌雄虫体内两种酪氨酸酶的转录差异,结果显示,不同时期的雄虫体内两种酪氨酸酶的转录水平均维持在接近于零的水平；在雌虫体内,两种酪氨酸酶从24天开始出现激增,至28天转录水平出现相对最高值。对两种酪氨酸酶进行了体外重组表达,将SjTYR1, SjTYR2勺全长序列插入到pSJ2载体中,使用大肠杆菌Rosetta Gami(DE3)进行表达,获得不可溶蛋白,除了全长蛋白表达外,SjTYR1,SjTYR2均出现较小分子量的蛋白表达,经质谱鉴定后为目的片段的截短表达蛋白；使用镍柱纯化后溶解于8M尿素中,获得纯度较高的重组蛋白。使用SjTYR1,SjTYR2重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA法测定两组重组蛋白的免疫兔血清的抗体滴度,抗体滴度值均达到1：512000,使用Western blot检测SjTYR1,rSjTYR2均具有很好的免疫原性,并且检测出rSjTYR2的兔多抗对SjTYR1也能识别,rSjTYR1的兔多抗对SjTYR2的全长表达片段能够识别,对截短表达片段不能识别。使用制备的抗rSjTYR1,rSjTYR2兔多抗对虫体蛋白进行Western blot检测,抗rSjTYR1兔多抗能够识别出大小约为100KDa勺目标片段,预测虫体内酪氨酸酶以二聚体的形式存在。使用重组蛋白免疫小鼠进行免疫保护实验研究,结果显示,经rSjTYR1免疫后的小鼠减虫率达到31.4%,减卵率达到了52.1%；经rSjTYR2免疫后的小鼠减虫率达到29.5%,减卵率为8.4%。使用RNA干扰的方法对两种酪氨酸酶SjTYR1和SjTYR2的功能进行进一步探究,化学合成的siRNA对日本血吸虫进行体外浸泡法进行干扰7天后,使用RT-PCR检测SjTYR1和SjTYR2的转录水平,结果显示siTyr1-1和siTyr2-1有较明显的干扰效果,使用SjTYR1和SjTYR2勺干扰片段同时进行干扰时效果更为明显,形态学上均未观察到干扰效果。
【关键词】：日本血吸虫 酪氨酸酶 Real-time PCR 转录特异性 免疫保护 RNA干扰
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：S852.7;R383.24
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第1章 研究背景13-21
• 1.1 血吸虫及血吸虫病研究概况13-17
• 1.1.1 血吸虫病的分类及地理分布13
• 1.1.2 日本血吸虫的生活史及致病机理13-14
• 1.1.3 日本血吸虫的流行现状14-15
• 1.1.4 血吸虫病的研究现状15-16
• 1.1.5 日本血吸虫的发育和产卵机制16
• 1.1.6 酪氨酸酶的分布及作用16-17
• 1.2 研究方法17-19
• 1.2.1 生物信息学方法17
• 1.2.2 RT-PCR技术17-18
• 1.2.3 RNA干扰技术18-19
• 1.3 研究内容及研究意义19
• 1.3.1 研究内容19
• 1.3.2 研究意义19
• 1.4 研究的技术路线19-21
• 第2章 日本血吸虫两种酪氨酸酶(Tyrosinase1,Tyrosinase2)的生物信息学分析21-26
• 2.1 实验方法21
• 2.2 实验结果21-24
• 2.2.1 SjTYR1和SjTYR2的基因序列分析21-22
• 2.2.2 SjTYR1和SjTYR2的氨基酸序列分析22
• 2.2.3 SjTYR1和SjTYR2蛋白质功能位点及结构域的预测22
• 2.2.4 SjTYR1和SjTYR2的氨基酸同源序列比对分析及系统分子进化树的构建22-24
• 2.3 小节与讨论24-26
• 第3章 日本血吸虫两种酪氨酸酶(Tyrosinase1,Tyrosinase2)原核重组质粒构建及表达和纯化26-41
• 3.1 实验材料及实验仪器,试剂26-28
• 3.1.1 实验材料26
• 3.1.2 实验仪器26-27
• 3.1.3 实验试剂27
• 3.1.4 常用溶液及试剂的配方27-28
• 3.2 实验方法28-35
• 3.2.1 分子克隆28-31
• 3.2.2 重组蛋白的小量表达31-32
• 3.2.3 重组蛋白的大量表达及纯化32-33
• 3.2.4 蛋白质免疫印迹(Westen Blot)分析33-34
• 3.2.5 PAGE胶割胶回收蛋白34
• 3.2.6 质谱测序分析鉴定蛋白34-35
• 3.3 实验结果35-40
• 3.3.1 SjTYR1和SjTYR2的PCR扩增结果35
• 3.3.2 pSJ2/SjTYR1和pSJ2/SjTYR2重组质粒的构建和验证35-36
• 3.3.3 重组蛋白的小量表达36-37
• 3.3.4 重组蛋白SjTYR1,SjTYR2的Western blot及质谱鉴定37-39
• 3.3.5 重组蛋白的大量表达与纯化39-40
• 3.4 小节与讨论40-41
• 第4章 日本血吸虫两种酪氨酸酶(Tryrosinase1,Tyrosinase2)兔多克隆抗体的制备与免疫原性分析41-48
• 4.1 实验材料及实验仪器,试剂41-42
• 4.1.1 实验材料41
• 4.1.2 实验仪器41
• 4.1.3 实验试剂41-42
• 4.2 实验方法42-43
• 4.2.1 rSjTYR1和rSjTYR2多克隆抗体的制备42
• 4.2.2 兔多克隆抗体的纯化42
• 4.2.3 间接ELISA法评价多克隆抗体滴度实验42-43
• 4.2.4 蛋白质免疫印迹法(Western blot)分析重组蛋白的免疫原性43
• 4.3 实验结果43-47
• 4.3.1 rSjTYR1和rSjTYR2多克隆抗体的制备43
• 4.3.2 间接ELISA法评价多克隆抗体滴度实验43-44
• 4.3.3 蛋白质免疫印迹分析44-47
• 4.4 小节与讨论47-48
• 第5章 日本血吸虫两种酪氨酸酶在日本血吸虫成熟阶段的转录特异性分析48-55
• 5.1 实验材料与实验仪器,试剂48
• 5.1.1 实验材料48
• 5.1.2 实验仪器48
• 5.2 实验方法48-51
• 5.2.1 日本血吸虫的感染实验49
• 5.2.3 不同时期日本血吸虫的获取49
• 5.2.4 日本血吸虫总RNA的抽提49-50
• 5.2.5 日本血吸虫总RNA的反转录50-51
• 5.3 实验结果51-54
• 5.3.1 日本血吸虫不同时期的虫体总RNA的浓度及质量测定51
• 5.3.2 SjTYR1基因和SjTYR2基因的转录特异性分析51-54
• 5.4 小节与讨论54-55
• 第6章 日本血吸虫两种重组酪氨酸酶蛋白的免疫保护实验55-58
• 6.1 实验材料与实验仪器,试剂55
• 6.1.1 实验材料55
• 6.1.2 实验仪器55
• 6.1.3 实验试剂55
• 6.2 实验方法55-56
• 6.2.1 分组设置及免疫方案55-56
• 6.2.2 取血方案56
• 6.2.3 日本血吸虫尾蚴攻击56
• 6.2.4 免疫保护效果评价56
• 6.3 实验结果56-57
• 6.4 小节与讨论57-58
• 第7章 利用RNA干扰技术分析酪氨酸酶(Tyrosinase1,Tyrosinase2)的功能58-66
• 7.1 实验材料与实验仪器,试剂58-59
• 7.1.1 实验材料58
• 7.1.2 实验仪器58
• 7.1.3 实验试剂58-59
• 7.2 实验方法59-62
• 7.2.1 化学合成siRNA干扰实验59
• 7.2.2 双链RNA(dsRNA)法干扰实验59-62
• 7.3 实验结果62-65
• 7.3.1 化学合成siRNA干扰实验62-63
• 7.3.2 dsRNA法干扰实验63-65
• 7.4 小节与讨论65-66
• 第8章 结论与展望66-68
• 8.1 结论66-67
• 8.2 展望67-68
• 参考文献68-73
• 致谢73-74

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 雷正龙;郑浩;张利娟;朱蓉;郭家钢;李石柱;王立英;陈朝;周晓农;;2010年全国血吸虫病疫情通报[J];中国血吸虫病防治杂志;2011年06期

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本文编号：1088134