应用大块平铺法对人脐带间充质干细胞分离、传代、冻存及复苏的研究

发布时间：2017-10-25 09:21

  本文关键词：应用大块平铺法对人脐带间充质干细胞分离、传代、冻存及复苏的研究

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【摘要】：目的：应用四种不同的培养方法进行人脐带间充质干细胞的分离、传代、冻存、复苏，比较各方法之间优劣,探索并建立一种简单、实用的人脐带间充质干细胞的培养方法，为再生医学以及实验研究提供新的培养人脐带间充质干细胞的方法。 方法：分别以1大块平铺法；2传统组织块法；3胶原酶Ⅳ消化法；4.胶原酶Ⅳ联合透明质酸酶消化法，四种不同的方法对脐带间充质干细胞进行细胞分离、培养、传代、冻存、复苏。镜下观察细胞形态，记录各组细胞首次融合时间、各组成功率，并以台盼蓝染色法测定细胞活性，以第3代细胞应用流式细胞术鉴定细胞免疫表型。 结果：1细胞形态：镜下可见贴壁细胞呈长梭形，无序生长，可呈涡旋状生长。2免疫表型鉴定：应用流式细胞术对大块平铺法培养的人脐带间充质干细胞进行免疫表型鉴定。结果显示：CD13、CD44、CD29、CD90、CD73、CD105均为阳性表达，CD14、CD31、CD45、CD34、HLA-DR均为阴性表达。3统计结果分析(由于胶原酶Ⅳ消化法无一例成功，则不做分析)。3.1首次融合时间：大块平铺法(17.81±0.85d)明显早于传统组织块法(24.89±0.97d)，差异有显著性（P＜0.05），但明显晚于胶原酶Ⅳ联合透明质酸酶消化法(7.35±0.61d)，，差异有显著性（P＜0.05）。3.2稳定传代：大块平铺法(11.08±0.74代)与传统组织块法(11.04±0.77代)无明显差别，差异无显著性（P＞0.05），但明显长于胶原酶Ⅳ联合透明质酸酶消化法(6.82±0.64代)，差异有显著性（P＜0.05）。3.3细胞活性：大块平铺法(90.84±0.83%)与传统组织块法(90.67±0.88%)无明显差别，不具有统计学意义(P＞0.05)，但明显高于胶原酶Ⅳ联合透明质酸酶消化法(75.06±0.90%)，有统计学意义（P＜0.05）。3.4成功率：大块平铺法与传统组织块法差异无显著性（P＞0.0167），但明显高于胶原酶Ⅳ联合透明质酸酶消化法，差异有显著性（P＜0.0167）。 结论：1脐带华通胶组织是人间充质干细胞的重要来源。2应用大块平铺法、传统组织块法以及胶原酶Ⅳ联合透明质酸酶消化法三种方法可成功培养人脐带间充质干细胞，而应用胶原酶Ⅳ消化法则很难成功培养人脐带间充质干细胞，原因在于华通胶组织中含有大量的透明质酸，单用胶原酶Ⅳ很难消化完全，需添加透明质酸酶联合消化方可行。3镜下可见人脐带间充质干细胞呈长梭形贴壁生长，可呈无序生长，呈涡旋状生长。4大块平铺法、传统组织块法以及胶原酶Ⅳ联合透明质酸酶消化法培养的人脐带间充质干细胞均可稳定传代、冻存、复苏，复苏后细胞增殖稳定。5大块平铺法实验操作上省去了剪碎以及铺块等最为繁琐的过程，比传统组织块法更为简便，而以往研究表明，酶消化法操作繁琐，不如传统组织块法简单。胶原酶Ⅳ联合透明质酸酶消化法是酶消化法的一种，同样操作繁琐，大块平铺法操作明显较胶原酶Ⅳ联合透明质酸酶消化法简单，且原代培养获得MSCs的时间要短于传统组织块法，提高了获得人脐带间充质干细胞的效率；以往研究表明，传统组织块法培养的人脐带间充质干细胞细胞活性要优于酶消化法，而大块平铺法细胞活性与传统组织块法无差别，明显优于胶原酶Ⅳ联合透明质酸酶消化法；大块平铺法培养人脐带间充质干细胞的成功率与传统组织块法无差别，且明显高于胶原酶Ⅳ联合透明质酸酶消化法。6应用流式细胞术检测大块平铺法培养的人脐带间充质干细胞免疫表型表明：CD13、CD44、CD29、CD90、CD73、CD105均为阳性表达，CD14、CD31、CD45、CD34、HLA-DR均为阴性表达，符合间充质干细胞的免疫表型。 因此大块平铺法是一种简单、实用的原代培养人脐带间充质干细胞的方法,本研究为再生医学以及实验研究提供了一种新的培养人脐带间充质干细胞的方法。
【关键词】：人脐带间充质干细胞 培养 大块平铺法 简单实用 流式细胞术
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 前言9-10
• 材料与方法10-15
• 结果15-17
• 附图17-23
• 附表23-24
• 讨论24-27
• 结论27-28
• 参考文献28-32
• 综述 人间充质干细胞的特性、临床应用及前景32-42
• 参考文献37-42
• 致谢42-43
• 个人简历43

【参考文献】

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1 汤天军;杨波;杨汉东;张有顺;胡礼仪;李东锋;张继红;;人脐带血间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞的实验研究[J];实用医学杂志;2005年21期

2 徐燕;李长虹;孟恒星;郝牧;邱录贵;;人脐带间充质干细胞分离培养条件的优化及其生物学特性[J];中国组织工程研究与临床康复;2009年32期

3 何培根,余正堂;体外用条件培养液诱导脐带血间充质干细胞分化成心肌细胞的实验研究[J];郧阳医学院学报;2002年04期

4 侯玲玲,曹华,魏国荣,白慈贤,张涌,吴祖泽,裴雪涛;人脐血间充质干细胞体外扩增和向神经元样细胞定向诱导分化的研究[J];中华血液学杂志;2002年08期

5 陈宇;张宁坤;杨明;沈燕华;王丽华;高连如;;脐带华通胶间充质干细胞的分离培养及鉴定[J];中国现代医学杂志;2010年16期

本文编号：1093076