中国登革Ⅲ型和Ⅳ型病毒分离株及登革Ⅳ型病毒减毒株特性研究

发布时间：2017-10-26 22:20

  本文关键词：中国登革Ⅲ型和Ⅳ型病毒分离株及登革Ⅳ型病毒减毒株特性研究

  更多相关文章： 登革4型病毒 毒力 序列分析 基因型 登革4型病毒 减毒株 毒力 免疫原性 空斑纯化 毒力位点 登革3型病毒 二级结构 亚型 进化树

【摘要】：Ban18株于1981年分离于我国西双版纳地区，将Ban18株和国际标准株H241株分别在Vero细胞和乳鼠脑内传代，用空斑法在Vero细胞单层上进行病毒滴度测定，结果表明两株病毒均对Vero细胞有致细胞病变作用，可以形成肉眼可见的空斑，病毒滴度分别为2.0×105PFU/mL和5.1×107PFU/mL。根据GenBank上已经提交的其它登革4型病毒全基因组序列，设计扩增Ban18株和H241株全基因组的引物，测定两株病毒的基因组序列，并进行比对。测序结果表明，两株病毒全长均为10664nt，含一个开放阅读框，，编码3387个氨基酸，两株病毒核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为99.7%和99.4%，全基因组中共有6个核苷酸差异位点和3个氨基酸差异位点。采用E基因区段序列对两株病毒进行基因分型，两株病毒均为基因Ⅰ型。 将登革4型病毒Ban18株及其在原代地鼠肾细胞上传代的减毒株（Ban18HK20和Ban18HK30株）在Vero细胞传代后进行生物学特征和基因序列特征的研究。结果表明，三株病毒均能被登革4型特异性腹水有效中和，中和指数1000，提示三株病毒均为登革4型病毒。Ban18HK20株和Ban18HK30株在Vero细胞上形成的空斑形态较其母株大且模糊。二者对9~11g小鼠的脑内lg(PFU/LD50）均4.5，而Ban18株的lg(PFU/LD50)为0.4，且二者对2~4日龄乳鼠的致病力也明显低于其母株Ban18株，说明表明Ban18株在传代过程中毒力逐渐减弱。将三株病毒稀释到106PFU/mL后免疫小鼠，两周后用国际标准株H241株进行脑内攻击，结果表明Ban18株和Ban18HK20株对H241脑内攻击的保护指数约为100，而Ban18HK30株对H241的脑内攻击基本没有保护作用，说明前二者的免疫原性较好。同时，为了获得毒力更低的毒株，本实验将两株减毒株Ban18HK20株和Ban18HK30株进行空斑纯化，分别挑选9个和5个空斑克隆进行空斑形态和5~6日龄乳鼠脑内毒力的比较，结果表明从Ban18HK20株挑选的9个克隆株中的3个毒株对乳鼠脑内毒力低于Ban18HK20原株，Ban18HK30株的5个克隆株则无明显差别。 比较Ban18株及其减毒株的全基因组序列，结果表明Ban18株和Ban18HK20株有8处核苷酸差异，其中3处引起氨基酸变化，即C111位、E155位、E369位和3’UTR219位，这几位变化可能与病毒毒力密切相关，特别是E155和3’UTR216，E155位会影响E蛋白的糖基化，3’UTR216位会改变3’UTR的二级结构。 桂登-1株（GD-1株）和桂登-11株（GD-11株）分离自1980年广西合浦县的登革热流行中，均为登革3型病毒。本研究将两株病毒在NIH乳鼠脑内传代两次后，病毒滴度达到3×103PFU/mL，同时将国际登革3型标准株标准株H87在乳鼠脑内传代一次，病毒滴度为2.6×105PFU/mL。前二者在Vero细胞单层上形成的空斑形态与H87株有明显差异。测定上述三株病毒的全基因组序列并进行分析，两株病毒全长均为10707nt，与H87株核苷酸同源性为96.0%，氨基酸同源性为98.8%。GD-1株和GD-11株间仅有4个氨基酸差异，二者和H87株分别存在39和41个氨基酸差异。对3’UTR二级结构进行预测，二者与H87株存在较大差异。根据E蛋白基因序列对两株病毒进行进化分析，结果表明二者均属于亚型Ⅱ，与分离自泰国的两株毒株进化关系最近。
【关键词】：登革4型病毒 毒力 序列分析 基因型 登革4型病毒 减毒株 毒力 免疫原性 空斑纯化 毒力位点 登革3型病毒 二级结构 亚型 进化树
【学位授予单位】：中国食品药品检定研究院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373
【目录】：

• 第一部分 我国云南分离株（Ban18）与国际登革 4 型标准株（H241 株）的生物学特性和全基因组序列比较研究5-33
• 中文摘要5-6
• 英文摘要6-7
• 前言7-9
• 材料和方法9-18
• 1 实验材料9-11
• 2 实验方法11-18
• 实验结果18-31
• 1 Ban18 株和 H241 株的生物学特征比较18-19
• 1.1 病毒滴度18
• 1.2 两株病毒特异性鉴定18-19
• 1.3 两株病毒脑内致病力比较19
• 2 Ban18 株和 H241 株全基因序列分析19-31
• 2.1 PCR 扩增结果19-20
• 2.2 H241 株和 Ban18 株的全序列比较20-27
• 2.3 Ban18 株与国内外其它登革 4 型病毒的序列比较27-28
• 2.4 Ban18 株系统进化分析28-31
• 讨论31-32
• 参考文献32-33
• 第二部分 云南登革 4 型版 18 株病毒减毒株的生物学特性和基因全序列研究33-61
• 中文摘要33-34
• 英文摘要34-35
• 前言35-38
• 材料和方法38-44
• 1 实验材料38-40
• 2 实验方法40-44
• 实验结果44-55
• 1 生物学特性44-52
• 1.1 Ban18 减毒株与其母株在 Vero 细胞上的生长曲线44-45
• 1.2 Ban18 减毒株与其母株在 Vero 细胞上空斑形成特征45
• 1.3 登革 4 型特异性血清对三株病毒的中和抑制作用45-46
• 1.4 三株病毒对小鼠的脑内致病力46-47
• 1.5 三株病毒的免疫原性比较47-48
• 1.6 Ban HK20 株和 Ban18 HK30 株各空斑克隆的生物学特征48-52
• 2 Ban18 减毒株与其母株的全基因序列比较52-55
• 2.1 两株病毒 PCR 扩增结果52-53
• 2.2 Ban18 减毒株与其母株的全基因序列比较53-55
• 讨论55-59
• 1 生物学特征研究55-57
• 2 基因序列特征分析57-59
• 参考文献59-61
• 第三部分 中国广西登革 3 型病毒分离株与国际 DEN-3 标准株的生物学和基因特征研究61-79
• 中文摘要61-62
• 英文摘要62-63
• 前言63-65
• 材料和方法65-68
• 1 实验材料65
• 2 实验方法65-68
• 实验结果68-76
• 1 病毒滴度和空斑形态68
• 2 PCR 扩增结果68-69
• 3 GD-1 株和 GD-11 株序列特征分析69-76
• 3.1 GD-1 株和 GD-11 株基因组结构特征69-70
• 3.2 两株病毒与国际标准株 H87 株同源性分析70-71
• 3.3 两株病毒与 H87 株的差异位点71-73
• 3.4 两株病毒系统进化分析73-76
• 讨论76-77
• 参考文献77-79
• 登革病毒减毒疫苗研究进展79-89
• 1 传统减毒疫苗79-81
• 2 新型减毒疫苗81-84
• 3 总结84-85
• 参考文献85-89
• 致谢89-90

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本文编号：1100720