下调CD151对脐带间充质干细胞生物学特性影响的初步研究

发布时间：2017-10-28 09:27

  本文关键词：下调CD151对脐带间充质干细胞生物学特性影响的初步研究

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【摘要】：背景：间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是多能成体干细胞的一种，起源于中胚层、可高度自我更新、且有多向分化潜能，广泛存在于全身组织如骨髓、脐血、脐带、绒毛膜、胎盘等，能在体外培养扩增，并能在体外特定诱导条件下分化成为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞等，MSCs独特的生物学特性是其具有广阔实验研究和临床应用的前提条件。4跨膜蛋白家族(TetraspaninSuper Family，TM4SF)是小分子糖蛋白中一员，4次跨细胞膜。不同种类的4跨膜蛋白或与其它跨膜蛋白在4跨膜蛋白密集微区(tetraspanin-enrichedmicrodomains，TEM)可以相互耦联成复合体，正是这个复合体结构使其具有重要生物学功能。CD151是四跨膜蛋白家族的重要成员之一，首次在血小板内皮细胞中发现，在细胞粘附，迁移，增殖，活化，肿瘤细胞生长，转移和成血管中起到关键作用。 目的：本实验室前期研究发现脐带间充质干细胞(umbilical cord-derived MSCs，UC-MSCs)几乎100%表达CD151，但到目前为止CD151对于UC-MSCs的生物学特性有何影响，尚无深入的报道，本实验就基于此实验结果开展。siRNA(smallinterference RNA)干扰UC-MSCs表面CD151，使UC-MSCs CD151表达下降。比较干扰后UC-MSCs生物学特性变化（如干细胞表面标记、诱导成脂、成骨分化能力），并初步检测其对UC-MSCs免疫调节、造血支持的影响。 方法：（1）采用胶原酶消化法分离出脐带组织的原代细胞，贴壁培养纯化方法传代细胞。流式细胞仪检测相关干细胞表面标记，，体外成脂、成骨诱导分化。（2）siRNA干扰UC-MSCs表面CD151，实验分为3组，实验组（siRNA-CD151group）：siRNA干扰UC-MSCs CD151;阴性对照组（siRNA-NC group）：siRNA干扰UC-MSCs非特异序列;空白对照组（Blank group）：不使用siRNA干扰UC-MSCs。24h、48h、72h后流式细胞仪分别检测干扰效率，筛选最佳干扰时间后实时定量PCR检测CD151mRNA表达情况；成脂、成骨诱导分化培养基比较3组细胞分化潜能；检测相关干细胞表型变化。（3）植物血凝素（PHA）刺激人外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)后分别与3组细胞建立共培养体系，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清中γ-干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)水平；Real-time PCR检测3组细胞免疫调节因子如HGF、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、环氧化酶(cyclooxygenase,COX-2)、人吲哚胺2，3-过氧化酶(indoleamine2,3-dioxygenase，IDO)mRNA水平。（4）免疫磁珠(MACS)分选脐血CD34+细胞，流式细胞仪检测分选效率，收集上述各组细胞条件培养基与CD34+细胞共培养，于第7d、14d、21d分别观察造血集落形态及统计造血集落总数。 结果： 1.分离脐带组织，培养UC-MSCs 酶消化所得的原代细胞符合干细胞形态特征，表达干细胞表面标记，可诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞； 2.siRNA干扰UC-MSCs细胞表面CD-151 （1）siRNA干扰72h为最佳干扰时间，实验组细胞膜表面CD151表达水平（11.97±2.63%）与对照组（95.66±1.56%）、空白组（95.48±4.04%）相比明显下降（P0.05，P0.05），实验组CD151mRNA表达水平与对照组、空白组相比下调均为7.7倍，差异明显降低（P0.01，P0.01）； （2）3组细胞贴壁生长，均为典型的成纤维细胞形态；流式细胞仪均可检测到3组细胞表面CD73、CD90、CD105和HLA-ABC；未检测到CD34、CD45：其中实验组CD105表达水平（83.37±0.71%）与对照组（93.66±0.21%）、空白组（91.87±0.75%）相比显著下降（P0.05，P0.05）； （3）在不同分化培养基状态下，尽管3组细胞均可向成骨、脂肪细胞分化：但是实验组脂滴与对照组、空白组相比无明显差异；而实验组中钙盐沉积体积减小，数量增加； 3.干扰CD-151后，对UC-MSCs免疫调节作用的影响 （1）PBMC，PHA与干扰后UC-MSCs细胞共培养，实验组上清中IFN-γ水平与对照组、空白组相比显著上升（P0.05，P0.05）。 （2）实验组中HGF、TGFβ-1的mRNA表达量相比于对照组和空白组，均明显降低（P0.01，P0.01）、COX-2mRNA升高（P0.05）、IDO无差异；ELISA检测实验组HGF分泌量亦同样下降（P0.01）； 4.干扰CD-151后，对UC-MSCs造血支持作用的影响 实验组和对照组细胞条件培养基均能形成造血集落，包括粒系集落形成单位(Colony forming unit-granulocyte，CFU-G)、粒-巨噬集落形成单位(Colony formingunit-granulocyte and macrophage，CFU-GM)、巨噬系集落形成单位(Colony formingunit-macrophage，CFU-M)，未观察到红细胞系集落形成单位（Colony formingunit-erythroid, CFU-E），集落体积较小，散在分布，数量较少，出现时间较晚，各组细胞间集落总数无差异；上述各种集落形成单位在阳性培养基中均可见；siRNA干扰UC-MSCs72h的条件培养基仍然具有促使CD34+细胞分化的作用，具备造血支持能力，CD34+细胞朝髓细胞系分化而不朝红细胞分化。 结论： 1.siRNA-CD151作用72h后可成功下调UC-MSC CD151mRNA表达，干扰CD151后UC-MSC仍保持干细胞表面标记，体外诱导成脂肪分化无明显变化，但可影响其成骨诱导分化能力； 2.siRNA-CD151能降低UC-MSC抑制PBMC分泌γ-干扰素的能力，其机制可能是通过相关可溶性免疫调节因子的表达改变从而影响其免疫调节作用； 3.siRNA干扰后细胞条件培养基仍然具有促使CD34+细胞分化的作用，具备造血支持能力，但2组细胞间集落总数无差异，表明CD151可能不是UC-MSC发挥造血支持作用的主要分子。
【关键词】：CD151 小干扰RNA 脐带间充质干细胞 生物学特性 免疫调节 造血支持
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329
【目录】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-10
• 目录10-11
• 第一部分 前言11-19
• 1.1 干细胞简述11-15
• 1.1.1 MSCs 的多向分化潜能11-12
• 1.1.2 MSCs 的免疫调节作用12-14
• 1.1.3 MSCs 的造血支持作用14-15
• 1.1.4 UC-MSCs 的特点15
• 1.2 CD151 概述15-18
• 1.2.1 CD151 的结构特点16
• 1.2.2 CD151 的组织分布16
• 1.2.3 CD151 与整合素16-17
• 1.2.4 CD151 的功能17-18
• 1.3 本研究的内容及意义18-19
• 第二部分 实验技术路线19-21
• 2.1 人脐带间充质干细胞的分离、培养、鉴定19
• 2.2 RNAi MSCs 表面 CD151 及检测干扰效率19-20
• 2.3 干扰 CD151 MSCs 对免疫调节的影响20
• 2.4 干扰 CD151 MSCs 对造血支持的影响20-21
• 第三部分 材料、试剂与仪器21-24
• 3.1 材料21
• 3.2 主要试剂21-22
• 3.3 主要仪器22-23
• 3.4 主要溶液配制23-24
• 第四部分 实验方法24-33
• 第五部分 实验结果33-45
• 5.1 UC-MSC 的生物学特性33-34
• 5.2 siRNA 干扰 UC-MSC34-39
• 5.3 干扰后对免疫调节影响39-42
• 5.4 干扰后对造血支持的影响42-44
• 实验结果小结44-45
• 第六部分 讨论、存在的问题及不足45-50
• 结论50-51
• 参考文献51-56
• 附录一 主要溶液配置56-57
• 附录二 英文缩略图表57-59
• 附录三 在校期间发表论文情况59
• 附录四 在校期间参加的学术会议59-60
• 致谢60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 房佰俊,韩钦,杨少光,赵春华;TGF-β1对成人骨髓CD105~+间充质干细胞增殖与分化的影响[J];西安交通大学学报(医学版);2005年03期

2 王小娜;李正;王tR;兰爱平;吴文;;TGF-β_1在雷奈酸锶促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中的作用[J];中国病理生理杂志;2011年12期

3 李丽娜;韩之波;王有为;罗伟峰;及月茹;杨舟鑫;冯莉;戚仁斌;李扬秋;韩忠朝;;人脐带间充质干细胞条件培养基体外支持造血的功能[J];中国实验血液学杂志;2012年04期

本文编号：1107674