人肝脏特异性miR-122重组慢病毒载体的构建与鉴定

发布时间：2017-10-28 17:16

  本文关键词：人肝脏特异性miR-122重组慢病毒载体的构建与鉴定

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【摘要】：目的构建microRNA-122(miR-122)的重组过表达慢病毒,并对其进行病毒包装、鉴定与滴度测定,为进一步研究miR-122的功能和作用机制奠定基础。方法利用PCR法扩增人类基因组DNA中miR-122发夹前体结构RNA,并将其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表达载体上,经酶切及基因测序鉴定,将阳性重组PCDH-CMV-miR-122-EF1a-GFP-puro表达载体、p CMV-VSV-G和p CMVdR8.91三质粒共转染到HEK-293T细胞,收获上清液,将所得病毒悬液浓缩后梯度稀释后感染HEK-293T细胞,并利用绿色荧光蛋白进行病毒滴度测定。将重组慢病毒转染原代培养人皮肤成纤维细胞,并利用实时定量PCR检测miR-122的表达。结果重组慢病毒表达载体PCDH-CMV-miR-122-EF1a-GFP-puro酶切及测序鉴定证明载体构建成功,并得到滴度为3×108TU/m L的病毒液。病毒感染人皮肤成纤维细胞后miR-122表达明显增强。结论通过优化miRNA载体构建方法成功构建人miR-122的重组慢病毒载体并可在人类成纤维细胞内显著过表达miR-122,为miR-122的研究提供更高效稳定的基因载体。
【作者单位】： 中山大学孙逸仙纪念医院小儿外科;中山大学;
【关键词】： miR- 慢病毒 载体构建
【基金】：国家自然科学基金资助项目(编号:30872700)
【分类号】：R373
【正文快照】： microRNA(miRNA)是一类广泛存在于真核生物的长度为21~25 nt的非蛋白质编码小RNA。它们不具有开放阅读框架,不编码蛋白质,以其序列特异性的方式在转录后水平调控基因的表达,参与多种重要的生命活动包括细胞增殖、凋亡、代谢等,从而受到广泛关注[1-3]。miRNA能够和互补或部分互

【共引文献】

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