大肠杆菌LTB联合EV71亚单位疫苗VP1鼻腔免疫效果评价

发布时间：2017-10-28 21:30

  本文关键词：大肠杆菌LTB联合EV71亚单位疫苗VP1鼻腔免疫效果评价

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【摘要】：手足口病是由肠道病毒感染引起的，可以产生多种并发症，严重者可致死。引发手足口病的肠道病毒以柯萨奇病毒A16型（coxsackievirus A16，Cox A16）和肠道病毒71型（enterovirus71，EV71）最为常见，VP1作为EV71的毒力蛋白具有极其重要的研究价值。VP1蛋白构象发生变化导致病毒释放RNA到宿主细胞，同时VP1蛋白也是病毒主要的表达抗原及中和表位。因此，VP1结构蛋白成为了发展肠道病毒71型亚单位疫苗的候选抗原。 耐热肠毒素（heat-stable enterotoxin，ST）和不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin，， LT)是产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)分泌的两种毒性蛋白。LT的B亚单位(Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit, LTB)已被研究证实是有效的粘膜免疫佐剂，与其它抗原联合进行粘膜免疫后可刺激机体产生强烈的系统免疫应答和粘膜免疫应答。 目的：构建重组产肠毒素大肠杆菌LTB基因的原核表达载体pET32a-LTB，检测诱导表达的6×His-LTB融合蛋白的免疫原性，并探讨EV71型VP1蛋白联合纯化LTB通过鼻腔粘膜免疫的效果。 方法：（1）构建重组质粒pET32a-LTB，转化Escherichia coliBL21(DE3), IPTG诱导表达。（2）表达的LTB融合蛋白带有6个His标签，可通过His标签琼脂镍柱纯化，纯化蛋白复性浓缩后经新西兰大白兔颈背部和后脚掌多点注射进行皮下免疫，抗原每次免疫的剂量为300μg，一共免疫3次，免疫间隔时间为2周，末次免疫7d后，用注射器从兔心脏直接取血，血液自然凝固后离心分离血清，采用间接ELISA法检测抗血清中IgG抗体效价。（3）分别用生理盐水、EV71VP1、LTB联合EV71VP1经鼻腔免疫BALB/c小鼠，一共免疫三次，免疫间隔时间为一周，第三次免疫10d后收集小鼠心脏血清、肺部冲洗液、小肠粘膜冲洗液，用间接ELISA法检测血清中抗原特异性IgG和粘膜冲洗液中抗原特异性IgA。 结果：（1）经过质粒双酶切鉴定、半定量PCR、质粒测序证实已成功构建重组原核表达质粒pET32a-LTB。（2）6×His-LTB融合蛋白在BL21(DE3)中的主要存在形式为包涵体，表达的目的蛋白相对分子质量（Mr）约为30kD；300ml菌液纯化的LTB蛋白复性浓缩至3ml后浓度为2.12mg／ml，ELISA检测其免疫兔所得抗血清IgG效价为1∶125000。（3）EV71VP1联合LTB免疫组的血清特异性IgG，肺部冲洗液和小肠粘膜冲洗液中特异性IgA抗体水平相较于EV71VP1单独免疫组和生理盐水对照组有明显增高，且差异具有统计学意义。 结论：已成功在E. coli BL21(DE3)中表达了6×His-LTB融合蛋白，纯化的融合蛋白具有良好的免疫原性和佐剂活性。通过滴鼻免疫，LTB可有效诱导和增强EV71VP1的粘膜免疫应答，提高特异性血清抗体效价，为研制高效安全的EV71口服疫苗奠定了基础。
【关键词】：LTB EV71 粘膜免疫
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 英汉缩略词对照5-8
• 摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 前言14-17
• 第一部分 LTB 的表达、纯化与免疫原性分析17-31
• 1 实验材料17-20
• 2 实验方法20-24
• 3 实验结果24-28
• 4 讨论与小结28-31
• 第二部分 EV71 VP1 联合 LTB 的鼻腔免疫评价31-39
• 1 实验材料31-32
• 2 实验方法32-34
• 3 实验结果34-37
• 4 讨论与小结37-39
• 全文小结39
• 本课题进一步试验计划39-40
• 参考文献40-43
• 文献综述 鼻腔粘膜免疫及其佐剂研究进展43-52
• 参考文献49-52
• 致谢52-53
• 攻读硕士学位期间的论文53-54

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：1110069