单纯疱疹病毒Ⅱ型感染细胞多肽ICP22对Vero细胞周期作用的研究

发布时间：2017-10-29 15:14

  本文关键词：单纯疱疹病毒Ⅱ型感染细胞多肽ICP22对Vero细胞周期作用的研究

  更多相关文章： 单纯疱疹病毒2型 感染细胞多肽22 复发感染 细胞周期

【摘要】：单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus,HSV）属于疱疹病毒科的α亚科，是最常见的人类病原体之一，有HSV-1和HSV-2两种血清型,两型核酸序列同源性高达70%,但感染方式与临床表现却有较大差异，且HSV-2感染较HSV-1感染更为普遍。HSV-2感染是一个复杂的过程，而且还涉及病毒的免疫逃逸机制，使病毒去除不干净。但是潜伏在神经节病毒是可以被激活的，从而成为一个棘手的临床问题。所以对HSV-2潜伏及复发机制的研究在为开发新药、清除潜在感染的病毒以及研制预防HSV-2感染的疫苗以提高患者的生活质量等具有重要的理论意义。 ICP22是一种HSV IE/α基因编码且具有多个结构基序的磷酸化蛋白，是一种非常重要的调节病毒基因表达的作用因子。在HSV感染时执行多种功能：（i）ICP22可定位于细胞核区与其他病毒蛋白协作来屏蔽宿主核功能以提高病毒感染。（ii）ICP22对多种病毒及细胞的启动子及增强子具有极强的抑制作用，如P53-mdm-2反式转录激活功能的抑制作用。（iii）ICP22通过对聚合酶II的影响从而影响病毒晚期基因的激活和表达。同时，研究发现ICP22能够影响一些细胞周期蛋白的活性和表达水平，促进细胞进入S期为病毒复制营造环境。负责CDK2的激活、减少细胞周期蛋白A和B的水平将细胞阻滞到G0/G1期与G2/M期间的S期。因此，ICP22与HSV-2从潜伏状态激活复发后进入复制增殖密切相关。 为此，以HSV-2333病毒全基因组为模板，特异性扩增HSV-2ICP22基因，经HindIII和KpnI双酶切并用T4连接酶连接ICP22基因与载体pEGFPN1，菌落PCR和双酶切鉴定阳性克隆，，最后测序鉴定重组质粒。提取质粒后瞬转至Vero细胞，荧光显微镜下观察转染36h后细胞中绿色荧光的分布情况并分析在Vero细胞中pEGFP-ICP22的表达过程。最后，RT-PCR鉴定ICP22基因的转录。转染Vero细胞后pEGFP-ICP22表达量的最大值出现在24h-48h间。 pEGFP-ICP22瞬转于Vero细胞后，MTT检测结果表明表达的融合蛋白对细胞的活性没有明显影响。细胞周期流式实验表明，重组质粒组S周期细胞占比率明显高于正常对照组、G2/M周期占比率也明显高于正常对照组，说明HSV-2ICP22促进Vero细胞进入S期，同时细胞可以顺利进入G2/M期。荧光定量PCR结果显示表达的HSV-2ICP22可上调cyclin E的表达水平，但对cyclin A及cyclin B的表达没有明显作用，同时WB结果验证了cyclin E的差异表达。 基于上述结果，表明HSV-2ICP22能通过上调cyclin E的表达激活CDK2促进细胞进入S期，但并没有减少细胞周期蛋白A和B的水平将细胞阻滞于S期。
【关键词】：单纯疱疹病毒2型 感染细胞多肽22 复发感染 细胞周期
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373.11
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 英文缩略词表11-13
• 第一章 绪论13-33
• 1.1 单纯疱疹病毒Ⅱ型概述13
• 1.2 HSV 的形态结构与基因表达13-16
• 1.3 HSV-2 的潜伏复发与感染治疗16-18
• 1.4 HSV ICP22 概述18-30
• 1.4.1 ICP22 与 US1.518-20
• 1.4.2 ICP22 屏蔽宿主核功能以提高病毒感染20-21
• 1.4.3 ICP22 与其它病毒蛋白的调控作用21-25
• 1.4.4 ICP22 与细胞周期25-30
• 1.5 本课题的研究意义及主要内容30-33
• 1.5.1 本课题的研究意义30-31
• 1.5.2 本课题的研究内容31-33
• 第二章 单纯疱疹病毒Ⅱ型感染细胞多肽 ICP22 真核表达载体的构建33-50
• 2.1 前言33
• 2.2 实验材料33-35
• 2.2.1 主要仪器33-34
• 2.2.2 菌株和质粒34
• 2.2.3 主要试剂34-35
• 2.3 技术路线35
• 2.4 实验方法35-42
• 2.4.1 Vero 细胞的培养35-36
• 2.4.2 HSV-2 的培养36
• 2.4.3 HSV-2 基因组提取及 ICP22 序列扩增36-37
• 2.4.4 凝胶电泳鉴定 PCR 产物37-38
• 2.4.5 凝胶回收纯化 PCR 产物38
• 2.4.6 重组质粒 pEGFPN1 的提取38-40
• 2.4.7 pEGFPN1 质粒的双酶切40-41
• 2.4.8 目的基因与质粒载体的连接41
• 2.4.9 感受细胞的制备以及连接产物的转化41
• 2.4.10 通过菌落 PCR 进行阳性克隆菌落的鉴定41
• 2.4.11 重组质粒的鉴定41-42
• 2.5 结果与讨论42-49
• 2.5.1 HSV-2 对 Vero 细胞的病变作用42-43
• 2.5.2 HSV-2 基因组电泳检测43
• 2.5.3 ICP22 序列的 PCR 扩增43-44
• 2.5.4 菌落 PCR 鉴定阳性克隆44
• 2.5.5 重组质粒 HindIII、KpnI 双酶切鉴定44-45
• 2.5.6 重组质粒 pEGFP-ICP22 测序鉴定45-49
• 2.6 讨论49
• 2.7 小结49-50
• 第三章 单纯疱疹病毒Ⅱ型感染细胞多肽 ICP22 在 Vero 细胞中的表达及鉴定50-58
• 3.1 前言50
• 3.2 实验材料50-51
• 3.2.1 主要仪器50
• 3.2.2 细胞、菌株和质粒50
• 3.2.3 主要试剂50-51
• 3.3 技术路线51
• 3.4 实验方法51-55
• 3.4.1 质粒提取51-52
• 3.4.2 测定质粒浓度52
• 3.4.3 质粒瞬时转染 Vero 细胞52-53
• 3.4.4 RT-PCR 鉴定 ICP22 的转录53-55
• 3.4.5 pEGFP-ICP22 表达过程的研究55
• 3.5 结果与讨论55-57
• 3.5.1 质粒在 Vero 细胞中的表达55
• 3.5.2 RT-PCR 鉴定 ICP22 在 Vero 细胞中的转录55-56
• 3.5.3 pEGFP-ICP22 在 Vero 细胞中的表达过程56-57
• 3.6 讨论57
• 3.7 小结57-58
• 第四章 单纯疱疹病毒Ⅱ型 ICP22 对 Vero 细胞周期的作用58-69
• 4.1 前言58
• 4.2 实验材料58-59
• 4.2.1 主要仪器58
• 4.2.2 细胞、菌株和质粒58-59
• 4.2.3 主要试剂59
• 4.3 技术路线59
• 4.4 实验方法59-63
• 4.4.1 MTT 法检测 Vero 细胞活性59-60
• 4.4.2 流式检测 ICP22 对 Vero 细胞周期的影响60
• 4.4.3 QPCR 检测周期蛋白的表达情况60-61
• 4.4.4 Western blot 鉴定周期蛋白 E 的表达61-63
• 4.4.5 统计学分析63
• 4.5 结果与讨论63-67
• 4.5.1 ICP22 对 Vero 细胞活性的影响63
• 4.5.2 ICP22 对 Vero 细胞周期的影响63-64
• 4.5.3 周期蛋白 E、A 和 B mRNA 相对定量分析64-67
• 4.5.4 Westen blot 鉴定周期蛋白 E 的表达67
• 4.6 讨论67-68
• 4.7 小结68-69
• 结论与展望69-70
• 参考文献70-74
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果74-75
• 致谢75-76
• 附件76

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 ;The Herpes Simplex Virus Type 1 Multiple Function Protein ICP27[J];Virologica Sinica;2008年06期

本文编号：1113509