人脐带Wharton’s jelly间充质干细胞的分离培养及基本生物学特性的研究

发布时间：2017-10-30 03:14

  本文关键词：人脐带Wharton’s jelly间充质干细胞的分离培养及基本生物学特性的研究

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【摘要】：干细胞是单个或成群存在的细胞,具有自我更新及分化潜能。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是源自中胚层的间充质、出现在已分化或特化组织中的干细胞。在适当的条件下,MSCs可具有定向分化为中胚层,外胚层及内胚层来源细胞的潜能,包括脂肪样细胞、骨样细胞、软骨样细胞、内皮样细胞、肌样细胞、肝样细胞、胰岛素分泌样细胞、神经元样细胞及神经胶质样细胞等,其广泛参与组织器官的损伤修复过程,是近年的研究热点。已有研究表明,在人脐带Wharton's jelly中存在丰富的MSCs,但目前尚缺乏标准的培养体系及“金标准的标记物”。本研究旨在建立一种快速、简便、经济、高效的人脐带Wharton's jelly源性间充质干细胞(Wharton's jelly mesenchymal stem cells, WJ-MSCs)的分离培养扩增体系,探讨其基本的生物学特性,为人脐带WJ-MSCs的基础研究和临床应用提供技术平台及奠定理论基础,为再生医学提供种子细胞源。 目的：建立人脐带WJ-MSCs的组织块培养法,观察人脐带WJ-MSCs的细胞形态和生长特点,检测膜表面标志物及分化潜能,探讨其基本的生物学特性。 方法：无菌条件下取健康足月剖腹产的脐带组织,在清除血管及外膜后,将Wharton's jelly用PBS清洗后剪成0.5～1.0mm3大小,并种植在培养瓶中,用含10%的FBS的低糖DMEM培养基培养,0.125%胰酶消化传代。在倒置显微镜下观察Wharton's jelly的形态特点和生长特征,免疫组化检测波形蛋白(Vimentin)的表达；流式细胞术检测WJ-MSCs的细胞免疫表型；用含地塞米松、胰岛素、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤(IBMX)的培养液诱导其分化为脂肪样细胞,并用油红O染色鉴定。以含IBMX和Forskolin的培养液诱导WJ-MSCs分化为神经样细胞,对诱导6.5小时的细胞用免疫组化检测巢蛋白(Nesting胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、神经丝(neurofilament, NF)及神经元烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)的表达。 结果：培养6天左右,在倒置相差显微镜下观察,有细胞从组织块边缘爬出,细胞为呈长梭形、短棒状或扁平样成纤维样细胞。10天左右,细胞为散在克隆团分布。传代后细胞生长速度加快,呈旋涡状、放射状分布。冻存复苏后,细胞仍保持强的增殖能力。P3细胞第1-2d为潜伏期,第3d数量开始增长,第4-6d为细胞对数生长期。Vimentin在WJ-MSCs为强阳性表达, WJ-MSCs表达CD44. CD90、CD105、CD34及CD45的阳性率分别为：100%、100%、99.7%、0.5%、0.1%。经成脂定向诱导后,WJ-MSCs胞体变圆,胞质出现脂滴,油红O染色为阳性。在IBMX联合Forskolin诱导WJ-MSCs定向分化6.5小时,细胞胞体收缩,有丝状突起,诱导后细胞有GFAP和NF表达,而Nestin和NSE为阴性。 结论：组织块培养法可以从人脐带Wharton's jelly中获取WJ-MSCs,其为成纤维样细胞,表达MSCs的膜表面标记物,并具有分化潜能,是理想的细胞移植和组织工程种子细胞。
【关键词】：间充质干细胞 脐带 Wharton's jelly 分离 培养 诱导 分化
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329
【目录】：

• 中英文缩略词5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-11
• 1.材料和方法11-17
• 2.实验结果17-22
• 3.讨论22-25
• 结论25-26
• 参考文献26-30
• 综述30-33
• 参考文献31-33
• 攻读硕士期间发表文章33-34
• 致谢34

【参考文献】

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本文编号：1115862