金葡菌噬菌体IME-SA1和IME-SA2基因组分析及金葡菌新型检测方法研究

发布时间：2017-11-02 03:29

  本文关键词：金葡菌噬菌体IME-SA1和IME-SA2基因组分析及金葡菌新型检测方法研究

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【摘要】：背景和目的 金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）在自然界中无处不在，水、空气、灰尘及动物和人的排泄物中都可找到。金葡菌是人类皮肤表面常见菌群，但它同时也是一种非常重要的致病菌，是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓性感染，也可引起伪膜性肠炎、肺炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症这类威胁人类生命的疾病。不仅仅是人类，家畜也容易感染金黄色葡萄球菌，金葡菌能够导致奶牛乳腺炎及鸡传染性关节炎，这严重威胁了食品安全，导致食品污染，带来重大经济损失。值得注意的是，耐药金葡菌的感染不断增加，例如，耐甲氧西林金葡菌（MRSA）和耐万古霉素金葡菌（VRSA）已引起更多关注，因为金葡菌是医院感染最常见的原因。 噬菌体是自然界中广泛存在的生物类群，几乎有细菌存在的地方就有相应噬菌体的存在，例如土壤、海水等。利用噬菌体和噬菌体裂解酶治疗细菌性感染的最新研究，表明噬菌体及其裂解酶是潜在的可代替抗生素用于治疗多重耐药菌感染的新型杀菌物质。作为细菌的天然杀手，噬菌体在治疗细菌性感染尤其是多重耐药菌感染方面具有抗生素无法比拟的优势：噬菌体能够在宿主体内进行自我复制，因此很小剂量的噬菌体制剂即可达到治疗目的；噬菌体特异性较强，仅能裂解其宿主菌或者同一种属内的细菌，对机体其他正常微生物群落影响很小，且不会感染人类细胞，副作用较小；噬菌体不易引起过敏反应，可用于对抗生素过敏的患者；噬菌体能够单独使用也可与其他杀菌物质联合使用；噬菌体可随致病菌变异而发生变异，产生裂解突变细菌的新的噬菌体。噬菌体裂解酶也有很多优势：可通过基因工程大量表达，并能高度纯化，底物特异性较强；较噬菌体而言，裂解酶不需要感染和复制，能更快地发挥杀菌作用；噬菌体裂解酶具有不同的结合域和催化域，分别用于细胞壁的结合和裂解，因此细菌不易对其产生抗性。 本研究中我们对分离到的两株金黄色葡萄球菌噬菌体进行了基因组学特征的研究、基因组的同源重组改造，并且建立了金葡菌新型检测方法，为金葡菌噬菌体的应用和检测金葡菌奠定了基础。 方法和结果 利用Ion Torrent测序方法对金黄色葡萄球菌噬菌体IME-SA1和IME-SA2进行测序，获得全部序列信息，拼接基因组并进行基因组分析，发现在其基因组尾端序列中存在大量的重复序列，而且这些重复序列是可变的，，从而导致PCR扩增出的序列长短不一，并且包含长的序列的噬菌体单克隆在培养繁殖之后PCR可扩增出较短序列，在短序列中没有发现此类现象。同时，我们结合两株噬菌体的基因组特征及其生物学特性方面的有关分析，发现两株噬菌体基因组同源性较高但裂解谱差异较大，因而对两株噬菌体进行同源重组改造，裂解谱较窄的噬菌体经过改造后具有与宽谱噬菌体同样的裂解谱，这项研究为后续研究噬菌体的裂解谱形成机制打下了基础。 为了建立特异定量检测金黄色葡萄球菌的新型检测方法，我们通过NCBI得到能够特异裂解金葡菌的溶葡球菌酶的基因，对溶葡球菌酶基因进行重新设计并进行密码子的优化，使其更易在大肠杆菌原核表达系统中进行可溶性表达，然后合成目的基因，将其构建到表达载体pQE30，最后成功地在大肠杆菌中表达了重组溶葡球菌酶lysostaphin，然后利用重组溶葡球菌酶lysostaphin结合ATP生物发光技术建立了特异定量检测金黄色葡萄球菌的方法。结论 随着金黄色葡萄球菌耐药性和致病性日趋严重，积极探索替代抗生素的新型治疗方法和建立快速检测金葡菌的方法势在必行。通过本研究，我们建立了高效的噬菌体同源重组技术，并且可以使用该技术对金葡菌的裂解谱进行人工改造，同时，利用重组溶葡球菌酶结合ATP发光法建立了快速、特异、定量检测金葡菌的方法，上述研究为金葡菌噬菌体的应用和金葡菌的检测打下了基础。
【关键词】：金黄色葡萄球菌 噬菌体基因组分析 基因组改组 重组溶葡球菌酶 ATP生物发光法 特异定量检测
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378.11
【目录】：

• 缩略语表6-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-18
• 第一部分 金黄色葡萄球菌噬菌体 IME-SA1 和 IME-SA2 基因组分析18-33
• 摘要18-19
• 1.材料与方法19-24
• 1.1 材料19
• 1.2 方法19-24
• 2.结果24-31
• 2.1 序列拼接及基因注释结果24-26
• 2.2 噬菌体 IME-SA1 和 IME-SA2 进化地位的分析26
• 2.3 噬菌体 IME-SA1 和 IME-SA2 尾端序列分析26-31
• 3.讨论31-33
• 第二部分 金黄色葡萄球菌噬菌体 IME-SA1 和 IME-SA2 的重组改造33-45
• 摘要33-35
• 1.材料与方法35-38
• 1.1 材料35
• 1.2 方法35-38
• 2.结果38-44
• 2.1 金黄色葡萄球菌噬菌体 IME-SA1 和 IME-SA2 裂解谱测定38
• 2.2 金葡菌噬菌体 IME-SA1 与 IME-SA2 基因组的比较分析38-41
• 2.3 金葡菌噬菌体 IME-SA2 基因组的打断41-42
• 2.4 通过同源重组获得以 IME-SA1 为母本、与 IME-SA2 具有相同裂解谱的重组噬菌体42-44
• 3.讨论44-45
• 第三部分 基于重组溶葡球菌酶和 ATP 生物发光技术快速特异定量检测金黄色葡萄球菌45-60
• 摘要45-46
• 1.材料与方法46-53
• 1.1 材料46-47
• 1.2 方法47-53
• 2.结果53-58
• 2.1 基因合成和重组质粒 pQE30-Lys 转化结果鉴定53-54
• 2.2 重组溶葡球菌酶的诱导表达与纯化54-55
• 2.3 重组溶葡球菌酶活性检测55-56
• 2.4 ATP 测定法与平板计数法56-58
• 2.5 基于 ATP 生物发光法和重组溶葡球菌酶特异性检测金黄色葡萄球菌58
• 3.讨论58-60
• 全文结论60-62
• 参考文献62-67
• 综述67-80
• 参考文献73-80
• 附录80-84
• 致谢84-85
• 攻读学位期间发表的学术论文目录85

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 唐倩倩;叶尊忠;王剑平;盖铃;应义斌;李雁斌;;ATP生物发光法在微生物检验中的应用[J];食品科学;2008年06期

2 李利霞;伍金娥;常超;张佳艳;王凌;;ATP生物发光检测技术的建立及应用可行性分析[J];食品科技;2012年01期

3 郝巧玲,吕斌,周宜开,程光明;生物发光法快速检测细胞内三磷酸腺苷[J];华中科技大学学报(医学版);2005年01期

4 马妮;赵虹;张旭;马景宏;;ATP发光技术快速检测食品中菌落总数[J];中国卫生工程学;2008年05期

本文编号：1129819