人FcγRIIB慢病毒表达载体的制备及其功能初步研究

发布时间：2017-11-02 05:25

  本文关键词：人FcγRIIB慢病毒表达载体的制备及其功能初步研究

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【摘要】：目的构建人FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体，检测人FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体在HT-1080细胞表面可调控的稳定表达，并初步研究其对B细胞功能的影响。 方法以人mRNA为模版逆转录获得FcγRⅡB基因片段，并将其克隆入慢病毒表达质粒TRE，构建TRE-FcγRⅡB慢病毒表达重组质粒。将慢病毒表达重组质粒TRE-FcγRⅡB、慢病毒调节质粒Tet分别与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞，分别包装表达病毒和调节病毒，分别测定表达病毒和调节病毒感染滴度。表达病毒和调节病毒共感染HT-1080细胞，经梯度浓度强力霉素（Dox）诱导，免疫荧光染色检测HT-1080细胞表达FcγRⅡB，实时定量PCR检测FcγRⅡB mRNA表达，，Western blot法检测FcγRⅡB蛋白表达。表达病毒和调节病毒共感染Ramos细胞，经1000ng/mL强力霉素（Dox）诱导，免疫荧光检测FcγRⅡB的表达和FcγRⅡB与SLE患者血清免疫复合物（IC）中IgG Fc端的结合能力。LPS刺激感染后的Ramos细胞，ELISA法检测过表达FcγRⅡB对Ramos细胞分泌IgM抗体的影响。 结果重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定，测序结果显示插入片段碱基序列与GenBank提供FcγRⅡB基因序列同源性100%。表达病毒滴度达106TU/mL，调节病毒滴度达105TU/mL，感染性良好。HT-1080细胞被病毒感染后经Dox诱导表达FcγRⅡB，免疫荧光染色结果显示FcγRⅡB能够在HT-1080细胞表达；实时荧光定量PCR和Western blot法结果显示FcγRⅡB表达水平与诱导剂浓度正相关。免疫荧光结果显示病毒感染后，Ramos细胞过表达FcγRⅡB且与IC中IgG Fc端有较好的结合能力。ELISA结果显示过表达FcγRⅡB会下调Ramos细胞的IgM分泌水平。 结论成功构建了FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体。经该慢病毒感染后Ramos细胞过表达FcγRⅡB且能下调该细胞分泌IgM型抗体的水平。
【关键词】：FcγRⅡB 慢病毒诱导表达载体 调控表达 抗体分泌
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-7
• 符号说明7-9
• 前言9-11
• 第一部分 人 FcγRⅡB 慢病毒表达载体的构建及其在 HT-1080 细胞的表达11
• 引言11
• 材料与方法11-25
• 结果25-27
• 讨论27-29
• 附图29-38
• 第二部分 过表达 FcγRⅡB 对 Ramos 细胞抗体分泌的影响38
• 引言38
• 材料与方法38-43
• 结果43-44
• 讨论44-46
• 附图46-49
• 全文总结49-50
• 参考文献50-53
• 综述53-67
• 参考文献60-67
• 致谢67-68
• 攻读硕士研究生期间发表的文章68

【参考文献】

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1 梁淑慧;李翠;刘志辉;朱海龙;;系统性红斑狼疮患者血循环免疫复合物和补体水平变化及其临床意义[J];国际医药卫生导报;2010年01期

本文编号：1130190