柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白原核表达、纯化及鉴定

发布时间：2017-11-02 22:04

  本文关键词：柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白原核表达、纯化及鉴定

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【摘要】：柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CV)可引起呼吸道感染、HFMD、发热性皮疹、疱疹性咽峡炎、及心肌炎、急性弛缓性麻痹和脑炎等疾病，柯萨奇A组16型VP1蛋白（CVA16VP1）是肠道病毒的主要的主要治病病原体。其VP1基因区编码的蛋白大多数都是CVA16病毒的抗原决定簇并决定病毒的抗原性。现阶段对于CVA16的研究还很薄弱，因此，本研究旨在通过基因原核表达与蛋白纯化获得VP1蛋白，并初步建立CVA16-IgM的酶联免疫捕获法，作为试剂制备和疫苗的评价方法。 本实验在安排和设计阶段做了很多工作：首先，根据实验室保存的含CVA16VP1、VP2和VP3全长序列克隆菌的测序报告，采用primer5.0软件设计VP1编码区上下游引物，从CVA16培养物当中扩增VP1蛋白基因序列，构建重组表达质粒pET-41a(+)/VP1；其次，进行菌落PCR来确定阳性克隆菌落，并双酶切初步鉴定为阳性的重组质粒pET-41a(+)/VP1转化大肠杆菌BL21-Gold (DE3) pLysS，测序验证正确后诱导表达，产物经SDS-PAGE分析蛋白表达情况，若结果与预期一致则进行诱导条件优化及表达产物纯化，并进行Western Blot鉴定免疫反应性；最后，，通过辣根过氧化物酶标记纯化后的重组蛋白VP1，以棋盘滴定法初步确定包被浓度和酶结合物使用浓度，初步建立ELISA捕获检测方法。 在经过了上述一系列是的实验后，我们获取了一定的成果：首先，成功扩增CVA16VP1蛋白基因片段，构建了重组质粒pET-41a(+)/VP1；其次，构建了可高效表达CVA16VP1蛋白的原核表达菌株，并确定了最佳诱导表达条件；SDS-PAGE表明重组蛋白与预期一致且呈包涵体表达；经亲和层析和离子交换层析法纯化，获取了纯化后蛋白的浓度，通过Adobe photoshop cs6分析得出重组蛋白的纯度；经Western Blot检测证实重组蛋白VP1能与相应抗体发生反应，具有良好的抗原性；最后，确定抗μ抗体最佳包被浓度和酶标抗原的最佳稀释倍数，初步建立了CVA-IgM的ELISA捕获检测方法。该方法特异性、灵敏度较好，有望用于柯萨奇病毒感染的早期诊断。
【关键词】：柯萨奇病毒A组 16型 VP1蛋白 原核表达 ELISA捕获法
【学位授予单位】：河南工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373.23
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 主要符号表10-11
• 第一章 绪论11-20
• 1.1 手足口病概述11
• 1.2 手足口病的主要病原体11
• 1.3 CVA16 的基因形态11-12
• 1.4 CVA16 的流行病学特征12-14
• 1.4.1 CVA 16 分子流行病学13-14
• 1.4.2 CVA 16 血清流行病学14
• 1.5 CVA 16 实验室诊断和病毒学监测14-16
• 1.5.1 病毒分离法15
• 1.5.2 病毒抗体检测法15-16
• 1.6 分子生物学的检测16-17
• 1.6.1 实时荧光定量 PCR( Real-time PCR)16-17
• 1.6.2 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)17
• 1.6.3 基因芯片技术( Microarray)17
• 1.7 CA16 的药物治疗及其局限性17
• 1.7.1 抗病毒药物的研究17
• 1.7.2 免疫球蛋白的研究17
• 1.8 CVA 16 的研究小结17-18
• 1.9 CVA 16 的预防18
• 1.10 项目意义18-20
• 第二章 材料与方法20-53
• 2.1 材料20-36
• 2.1.1 受体菌20
• 2.1.2 主要试剂20-21
• 2.1.3 实验主要用液的配制21-35
• 2.1.4 主要仪器与设备35-36
• 2.2 方法36-53
• 2.2.1 CVA 16 VP1 抗原的克隆与鉴定36-43
• 2.2.2 重组抗原蛋白（VP1）的表达、纯化及鉴定43-50
• 2.2.3 捕获 ELISA 方法的建立50-53
• 第三章 结果与分析53-60
• 3.1 VP1 基因片段的扩增和 pET-41a(+)/VP1 重组质粒的构建53-54
• 3.1.1 PCR 扩增 VP1 目的基因片段53
• 3.1.2 菌落 PCR 鉴定53-54
• 3.1.3 重组质粒 pET-41a(+)/VP1 的双酶切鉴定54
• 3.1.4 酶切产物的测序鉴定54
• 3.2 重组蛋白 VP1 的原核表达、纯化及鉴定54-58
• 3.2.1 重组蛋白 VP1 的诱导表达54-55
• 3.2.2 重组蛋白 VP1 的表达条件的优化55-56
• 3.2.3 重组蛋白 VP1 的的纯化56-57
• 3.2.4 重组蛋白 VP1 蛋白的 Western Blot 鉴定57
• 3.2.5 蛋白浓度的测定57-58
• 3.3 捕获法的初步建立58-60
• 3.3.1 阴阳血清筛选58
• 3.3.2 棋盘法确定包被浓度和酶结合物工作浓度58
• 3.3.3 交叉反应实验58
• 3.3.4 精密性试验58-60
• 第四章 讨论60-63
• 4.1 VP1 基因的选取60
• 4.2 加入连接臂60-61
• 4.3 诱导条件的优化61
• 4.4 重组抗原纯化方法的选择61-62
• 4.5 ELISA 捕获法检测方法的建立62-63
• 第五章 结论63-64
• 参考文献64-70
• 附录70-71
• 致谢71-73
• 个人信息73-74
• 个人简历73-74
• 攻读学位期间发表文章情况74

【参考文献】

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本文编号：1133343