应用消减SELEX技术筛选乙肝表面抗原特异性核酸适配体

发布时间：2017-11-03 06:09

  本文关键词：应用消减SELEX技术筛选乙肝表面抗原特异性核酸适配体

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【摘要】：目的核酸适配体是从人工构建的随机单链寡核苷酸文库中,利用SELEX技术筛选出来的能够与靶分子高特异性、高亲和力结合的特异性单链寡核苷酸序列。核酸适配体具有容易制备、纯度高；易于被修饰；靶分子范围广；亲和力高、特异性好；分子量小、稳定性好等特点。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)造成的可能威胁生命的肝脏感染。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是HBV感染的主要标志,也是HBV感染者最早出现的血清学指标,对乙型肝炎的早期诊断具有重要意义。HBV感染早期,患者血中的HBsAg含量极低,用现有的检测试剂、检测方法可能检测不到,导致假阴性结果,延误治疗时机。本实验对HBsAg的特异性核酸适配体进行筛选,以达到为HBsAg特异性核酸适配体运用于乙型肝炎临床早期诊断奠定基础的目的。 方法本实验以HBsAg做为靶分子,以环氧树脂做为筛选介质,采用消减SELEX技术筛选HBsAg的特异性核酸适配体,同时采用蛋白质-核酸斑点杂交实验对筛得的次级文库进行鉴定,观察其与HBsAg的结合能力。通过酶切、连接、转化获得单个克隆,从而将次级文库中的不同序列区分开来。然后采用蛋白质-核酸斑点杂交实验对单个克隆进行鉴定,得到与HBsAg高特异性、高亲和力结合的单链DNA(ssDNA),然后对该ssDNA进行测序并分析其二级结构。 结果(1)经过16轮筛选,获得了针对HBsAg的富集文库,蛋白质-核酸斑点杂交实验证实,筛到的次级文库与HBsAg良好结合。(2)转化、克隆后,采用蛋白质-核酸斑点杂交实验证实H4-1、H4-4、H4-6与HBsAg高特异性、高亲和力结合,测序后分析其二级结构以茎环结构为主。 结论本实验成功筛得HBsAg的3条特异性核酸适配体,为核酸适配体用于HBsAg的早期微量检测奠定了基础。
【关键词】：乙型肝炎表面抗原 SELEX技术 核酸适配体
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-7
• 目录7-10
• 第一章 绪论10-24
• 1.1 核酸适配体11-13
• 1.1.1 核酸适配体概述11
• 1.1.2 核酸适配体与靶分子的相互作用原理11-12
• 1.1.3 核酸适配体的特点12-13
• 1.2 SELEX技术13-19
• 1.2.1 SELEX技术的起源13
• 1.2.2 SELEX技术的基本原理13-15
• 1.2.3 SELEX技术的发展15-19
• 1.3 核酸适配体在临床诊断中的应用19-21
• 1.3.1 双位点结合测定(two-site binding assays)19
• 1.3.2 流式细胞术(flow cytometry,FC)19-20
• 1.3.3 生物传感器(biosensors)20
• 1.3.4 荧光偏振分析(fluorescence polarization,FP)20
• 1.3.5 分子信标(molecular beacon)20
• 1.3.6 毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)20-21
• 1.4 核酸适配体在临床治疗中的应用21-23
• 1.4.1 抗病毒治疗21
• 1.4.2 抗寄生虫治疗21
• 1.4.3 抗肿瘤治疗21-22
• 1.4.4 抗凝血治疗22
• 1.4.5 抑制血管增生22-23
• 1.5 展望23-24
• 第二章 利用SELEX技术筛选HBsAg的特异性核酸适配体24-40
• 2.1 前言24-25
• 2.2 材料与仪器25-28
• 2.2.1 实验材料25-26
• 2.2.2 主要试剂26
• 2.2.3 主要溶液的配制26-28
• 2.2.4 主要仪器28
• 2.3 方法28-34
• 2.3.1 靶分子HBsAg的活性检测28
• 2.3.2 HBsAg与筛选介质环氧树脂的结合能力测定28-29
• 2.3.3 HBsAg特异性核酸适配体的筛选29-32
• 2.3.4 蛋白质-核酸斑点杂交实验鉴定HBsAg-ssDNA复合物32-34
• 2.3.5 实时荧光定量PCR鉴定ssDNA富集程度34
• 2.4 结果34-38
• 2.4.1 HBsAg的活性检测34-35
• 2.4.2 HBsAg与环氧树脂的结合能力测定35
• 2.4.3 HBsAg与混合纤维素酯滤膜的结合能力35-36
• 2.4.4 SELEX筛选后ssDNA富集程度36
• 2.4.5 制备dsDNA模板的最佳循环数36
• 2.4.6 制备ssDNA的最佳循环数36-37
• 2.4.7 ssDNA~(-b)上生物素的活性37
• 2.4.8 次级文库蛋白质-核酸斑点杂交实验37-38
• 2.4.9 实时荧光定量PCR鉴定ssDNA富集程度38
• 2.5 讨论38-40
• 第三章 HBsAg特异性核酸适配体的克隆、鉴定和测序40-49
• 3.1 材料与仪器40-41
• 3.1.1 实验材料40
• 3.1.2 主要试剂的配制40
• 3.1.3 主要溶液的配制40-41
• 3.1.4 主要仪器41
• 3.2 方法41-45
• 3.2.1 次级文库寡核苷酸的克隆41-43
• 3.2.2 通用引物和特异引物交错PCR鉴定阳性克隆43-44
• 3.2.3 蛋白质-核酸斑点杂交实验筛选与HBsAg结合的核酸适配体44-45
• 3.2.4 测序及二级结构预测45
• 3.3 结果45-48
• 3.3.1 阳性克隆的鉴定45
• 3.3.2 阳性克隆ssDNA~(-b)的制备45-47
• 3.3.3 阳性克隆蛋白质-核酸斑点杂交实验47
• 3.3.4 HBsAg特异性核酸适配体序列及其二级结构47-48
• 3.4 讨论48
• 3.5 结论48-49
• 参考文献49-54
• 在学期间的研究成果54-55
• 致谢55

【共引文献】

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1 夏梦翎;β-环糊精的改性及在核酸纯化中的应用[D];中南民族大学;2012年

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本文编号：1134951